当前，嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T）在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了革命性成功。然而，传统疗法依赖于在体外对患者自身的T细胞进行提取、基因改造、扩增和回输。这个过程被称为“离体”制造，它不仅耗时长达数周，而且成本极其高昂，极大地限制了这项尖端疗法的可及性。此外，通过逆转录病毒或慢病毒（LVV）进行的基因递送通常会导致CAR基因在基因组中随机整合，这种“散装”方式可能带来基因表达不均、致癌风险（插入突变）等潜在问题，且非特异性地改造其他细胞（如肿瘤细胞本身）也可能引发抗原逃逸等耐药机制。
为了跨越这些障碍，科学家们设想：能否直接在患者体内对T细胞进行“现场施工”，即跳过复杂的体外制造流程，实现CAR-T细胞的“在体”（in vivo）生成？这不仅有望大幅降低治疗成本和时间，还可能因“施工现场”就在体内，而生成分化程度更低、更具持续战斗力的T细胞。然而，在体生成CAR-T细胞面临巨大挑战：现有方法要么（如通过脂质纳米颗粒递送mRNA）只能实现短暂的CAR表达，疗效不持久；要么（如通过工程化慢病毒）虽然能实现稳定表达，但存在递送缺乏细胞特异性、基因随机整合以及将CAR意外导入肿瘤细胞导致耐药的风险。因此，实现稳定、特异且精准（定点整合）的在体T细胞重编程，一直是领域内梦寐以求的目标。
针对这一系列难题，一项发表于《自然》期刊的研究给出了突破性的答案。研究人员开发了一种创新的双载体系统，成功在动物模型体内实现了CAR大片段DNA在T细胞基因组特定位点的精准“插入”，生成了强大且持久的抗癌T细胞军队。
该研究主要运用了几项关键技术：1. 利用经抗体片段（scFv）靶向修饰的包膜递送载体，特异性且高效地将CRISPR-Cas9基因编辑“剪刀”递送至T细胞；2. 通过定向进化技术，筛选出能抵抗人体血清中和抗体、并特异性靶向T细胞表面CD7分子的新型腺相关病毒变体，用于递送同源修复模板；3. 将无启动子的CAR基因设计在同源修复模板中，靶向整合至T细胞特异性的T细胞受体α恒定区基因座，从而在破坏内源性TCR的同时，实现CAR在T细胞中的生理性、特异性表达。研究所用人源化小鼠模型及其中的人外周血单个核细胞均来源于健康供体。
靶向的在体转基因整合
研究团队首先构建了一个由包膜递送载体和腺相关病毒组成的双载体系统。其中，包膜递送载体负责递送靶向TRAC基因的Cas9-sgRNA核糖核蛋白，用于在T细胞基因组特定位点制造DNA双链断裂；腺相关病毒则递送一个携带无启动子CAR基因序列的同源修复模板。在体外实验中，该系统成功地在人原代T细胞中生成了CAR+TCR-的TRAC-CAR T细胞。在免疫健全的人源化小鼠模型中，初步实验也证实了该系统可在体内生成约3%的CAR T细胞，并导致B细胞发育不全，证明了所生成T细胞的功能活性。
工程化载体提升特异性和效率
研究人员认识到，原始的腺相关病毒6型和包膜递送载体在体内应用面临三大障碍：对血清中和抗体敏感、缺乏对T淋巴细胞的特异性、以及体内循环T细胞池有限。为此，他们进行了针对性的优化：
- 1.
进化出新型AAV变体：通过在存在人血清的条件下对T细胞进行三轮筛选，进化出一种对血清中和抗体具有抵抗力、且转导效率更高的腺相关病毒变体，命名为AAV-hT7。机制研究发现，其转导高度依赖于T细胞表面表达的CD7分子。
- 2.
开发靶向性包膜递送载体：将包膜载体表面的野生型水泡性口炎病毒G糖蛋白替换为靶向CD3的抗体片段，并突变其天然受体结合域，从而极大地增强了对T细胞的特异性靶向和激活能力。
- 3.
验证系统特异性：通过将报告基因定点整合到广泛表达的网格蛋白基因中进行测试，发现优化后的“抗CD3-包膜递送载体 + AAV-hT7”组合展现出卓越的细胞选择性，能高效编辑CD4+和CD8+T细胞，同时显著降低了对造血干细胞、自然杀伤细胞以及一系列B细胞肿瘤细胞系的非特异性编辑。
抗CD3-包膜递送载体和AAV-hT7改善在体基因敲入
在克服了异种移植物抗宿主病干扰的免疫缺陷小鼠模型中，研究人员系统评估了四种载体组合的在体编辑效率。结果显示，优化的“抗CD3-包膜递送载体 + AAV-hT7”组合表现最佳，能在高达19.7%的脾脏T细胞中实现CAR的定点整合，并导致完全的B细胞发育不全。对生成细胞的分析表明，这是一群高度增殖、同时保留部分记忆/前体耗竭表型标志物、且调节性T细胞频率较低的CAR T细胞。
在体生成的TRAC-CAR T细胞控制B-ALL
在B细胞急性淋巴细胞白血病模型中，单次注射优化载体组合，在使用四个不同供体外周血单个核细胞的实验中，20只小鼠里有18只达到了完全缓解，并展示出长期抗肿瘤记忆。与通过慢病毒在体生成或通过体外制造的传统CAR T细胞相比，在体定点整合生成的TRAC-CAR T细胞扩增更迅速、峰值更高，能更有效地控制肿瘤，并且CAR表达水平更高、更均一。
在体生成的TRAC-CAR T细胞用于多发性骨髓瘤和肉瘤模型
研究进一步将该平台拓展至靶向B细胞成熟抗原的多发性骨髓瘤模型和靶向B7-H3的软组织肉瘤模型。在两种模型中，单次注射优化载体均能诱导显著的抗肿瘤反应，部分动物达到完全缓解，证明了该平台在治疗血液瘤和实体瘤方面的广泛潜力。
研究结论与讨论
本研究成功开发了一种在体对原代人类T细胞进行大片段DNA定点整合的方法。通过联合使用CD3靶向的Cas9-包膜递送载体和对血清中和抗体具有抵抗力的T细胞嗜性腺相关病毒，研究人员在多种肿瘤模型中实现了治疗水平的TRAC-CAR T细胞生成和肿瘤控制。这项工作的核心意义在于：
- 1.
精准性与安全性：该方法通过“细胞特异性递送（靶向CD3的包膜载体 + 依赖CD7的AAV） + 基因座特异性表达（TRAC启动子）”的多重保障，实现了前所未有的编辑特异性，最大程度降低了脱靶编辑和非T细胞表达CAR的风险，后者是导致抗原阴性复发的重要机制。
- 2.
高效性与优越性：在体生成的TRAC-CAR T细胞得益于在TRAC基因座的定点整合，其CAR表达由内源性启动子驱动，呈现均一、动态且生理性的表达模式。这使其在体内展现出比随机整合的慢病毒CAR T细胞更早、更强、更持久的扩增与抗肿瘤活性。
- 3.
可及性与平台性：该技术绕过了复杂的离体细胞制造流程，为实现“即用型”在体CAR-T疗法铺平了道路，有望极大降低治疗成本、缩短等待时间，使更多患者受益。此外，该双载体系统（瞬时递送编辑蛋白 + 高效核递送DNA模板）本身是一个可扩展的平台，未来可兼容PASTE、PASSIGE、CAST等新型大片段整合技术，用于在体整合T细胞受体或其他合成受体，实现对T细胞功能的多样化重编程。
总之，这项研究标志着在体细胞疗法领域的一个重要里程碑。它不仅为开发更高效、精准、可及的CAR-T疗法提供了切实可行的新路径，其构建的递送与整合平台也为未来更广泛的在体细胞重编程治疗奠定了基础。尽管其安全性和有效性在免疫系统完整的大型动物模型中仍需进一步验证，但这项突破无疑让我们向“一次注射，生成抗癌军队”的终极梦想迈出了关键一步。
