摘要：本研究旨在探讨TROP‑2靶向嵌合抗原受体T细胞（TROP‑2‑targeted Chimeric Antigen Receptor T‑cell，TROP‑2 CAR‑T）联合血管破坏剂PLG‑g‑mPEG/CA4/BLZ945（CBP）在三阴性乳腺癌（Triple‑Negative Breast Cancer，TNBC）中的协同抗肿瘤潜力。研究人员假设CBP可破坏肿瘤新生血管，从而促进CAR‑T细胞向肿瘤内的浸润。研究人员通过生物信息学分析、实时荧光定量PCR（quantitative Real‑Time PCR，qRT‑PCR）及测序检测乳腺癌中TROP‑2的表达；体外构建并评价TROP‑2 CAR‑T细胞功能；建立乳腺癌小鼠模型，在体内验证TROP‑2 CAR‑T联合CBP的抗肿瘤疗效、安全性及生物学机制。生物信息学与体外实验显示TROP‑2在乳腺癌细胞中广泛高表达，成功构建的TROP‑2 CAR‑T细胞在体外具高细胞毒性。小鼠实验结果表明，CBP与TROP‑2 CAR‑T联合治疗显著增强抗肿瘤效应，且未观察到存活率明显下降及主要器官损伤。机制研究表明，联合治疗组的抗肿瘤作用可能与免疫细胞浸润增加、CAR‑T细胞肿瘤浸润增多及免疫相关因子上调有关。研究结果表明TROP‑2是乳腺癌CAR‑T治疗中可行的靶点，TROP‑2 CAR‑T细胞联合CBP不仅增强治疗效果且保持良好的安全性，为乳腺癌治疗提供了一种有前景的新策略。
论文解读：TROP‑2靶向CAR‑T细胞联合血管破坏剂CBP增强三阴性乳腺癌抗肿瘤活性研究
本研究由中国人民解放军总医院第一医学中心普通外科Chen Yizhu、Wang LiSheng、Jiang Jian等学者完成，发表于《Translational Oncology》。三阴性乳腺癌（Triple‑Negative Breast Cancer，TNBC）缺乏雌激素受体（Estrogen Receptor，ER）、孕激素受体（Progesterone Receptor，PR）及人表皮生长因子受体2（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2，HER2）表达，无法从内分泌及抗HER2靶向治疗中获益，占乳腺癌15%–20%，侵袭性强、易复发转移，预后差。嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T‑cell，CAR‑T）疗法在血液肿瘤中疗效显著，但在实体瘤中受限于T细胞耗竭（T‑cell Exhaustion）及抑制性肿瘤微环境（Tumor Microenvironment，TME），尤其实体瘤新生血管异常形成物理与免疫屏障阻碍CAR‑T浸润。TROP‑2（Trophoblast Cell Surface Antigen 2，TACSTD2）在包括乳腺癌在内的多种实体瘤中过表达，尤在TNBC中与不良无病生存（Disease‑Free Survival，DFS）相关，已被验证为治疗靶点（如已上市TROP‑2抗体偶联药物Sacituzumab govitecan）。本研究假设采用聚合物血管破坏剂PLG‑g‑mPEG/CA4/BLZ945（CBP，含Combretastatin A‑4即CA4及集落刺激因子1受体抑制剂BLZ945共价偶联于聚谷氨酸‑聚乙二醇接枝物PLG‑g‑mPEG）破坏肿瘤不成熟新生血管、重塑TME，可增强TROP‑2 CAR‑T细胞在TNBC中的浸润与疗效，并评估其安全性与潜在机制。
研究人员开展的主要关键技术方法如下：利用GEPIA3平台进行TROP‑2泛癌及乳腺癌亚型表达与生存分析；收集解放军总医院乳腺癌及癌旁组织行免疫组化学（Immunohistochemistry，IHC）及qRT‑PCR验证TROP‑2表达，分离患者肿瘤相关间质前体细胞（Mesenchymal Precursor Cells，MPCs）行转录组测序；构建第二代4‑1BB共刺激、CD3ζ信号域的TROP‑2 scFv慢病毒载体并制备人源TROP‑2 CAR‑T细胞，以荧光标记TROP‑2蛋白及流式细胞术检测转染效率，LDH释放法及荧光素酶报告系统评估体外杀伤；建立MDA‑MB‑231细胞系皮下荷瘤NOD‑SCID（NTG）小鼠模型，随机分组给予PBS、单药CBP（20 mg/kg）、单药TROP‑2 CAR‑T（5×106 cells/鼠）及CBP+CAR‑T联合治疗，监测肿瘤体积、体重、生存率，终点取肿瘤及脏器行H&E染色、多重免疫荧光（Multicolor Immunohistochemistry/mIHC）、外周血常规、qPCR检测瘤内CAR‑T（WPRE元件）及凋亡/炎症因子基因表达。
Expression analysis of TROP‑2 in breast cancer（乳腺癌中TROP‑2的表达分析）
研究人员通过GEPIA3分析发现TROP‑2在多种肿瘤中高表达，在乳腺癌各分子亚型中表达升高，高TROP‑2表达与TNBC患者较低DFS相关；临床标本IHC显示癌组织TROP‑2表达约为正常乳腺组织2倍，qPCR示各乳腺癌细胞系均有表达且TNBC细胞系（MDA‑MB‑231）最强。结论：TROP‑2在TNBC中显著过表达且与不良预后相关，是可行治疗靶点。
Analysis of TROP‑2 expression in the tumor microenvironment of patients with breast cancer（乳腺癌患者肿瘤微环境中TROP‑2的表达分析）
研究人员从患者乳腺癌标本分离培养MPCs，转录组测序及qPCR显示TROP‑2在肿瘤相关MPCs中表达约为正常乳腺基质间充质干细胞5倍。结论：TROP‑2亦高表达于乳腺癌TME中部分基质细胞，提示CAR‑T可能同时靶向肿瘤及相关促癌基质成分。
Construction and evaluation of TROP‑2 CAR‑T cells（TROP‑2 CAR‑T细胞的构建与评价）
研究人员以pLVX‑EF1α载体构建含TROP‑2 scFv、IgG4铰链区、CD28/4‑1BB（实为4‑1BB/CD3ζ第二代结构—原文述含4‑1BB intracellular domain及CD3ξ motif）胞内信号之慢病毒，感染活化人外周血T细胞，MOI=40时CAR+ 阳性率约46.2%；体外对不同乳腺癌细胞系具显著剂量依赖性杀伤，对MDA‑MB‑231‑luc细胞效靶比1:10时杀伤率达94%。结论：成功构建具特异性、高效杀伤TNBC细胞毒性的第二代TROP‑2 CAR‑T细胞。
Antitumor effects of CBP combined with CAR‑T cells in vivo（CBP联合CAR‑T细胞体内抗肿瘤效果）
研究人员在MDA‑MB‑231荷瘤小鼠中证实，CBP+CAR‑T联合组肿瘤体积增长显著受抑，终末肿瘤重量仅为PBS对照组18%（0.26 g vs 1.43 g），各组生存率无显著差异下降（仅PBS组死1只），体重波动在可接受范围，瘤内见大面积坏死。结论：CBP联合TROP‑2 CAR‑T在体内显著抑制TNBC移植瘤生长，未见明显治疗相关致死毒性。
Safety evaluation（安全性评价）
研究人员对主要脏器H&E染色未见联合治疗致明显器质性损伤；肺组织联合治疗组转移结节减少；CBP单药及联合组外周血红细胞（Red Blood Cell，RBC）、血红蛋白（Hemoglobin，HBG）、白细胞（White Blood Cell，WBC）计数较对照组下降（p<0.05或p<0.01），提示CBP可能存在一定程度骨髓抑制。结论：联合方案主要脏器安全性良好，但CBP可伴轻中度血液学毒性需关注。
Mechanism exploration（机制探索）
研究人员通过流式及mIHC发现联合组外周血CD3+ T细胞及瘤内CD8+ T细胞浸润显著增加，M1型巨噬细胞增多、M2型减少，免疫原性细胞死亡（Immunogenic Cell Death，ICD）标志物HMGB1（High Mobility Group Box 1）及钙网蛋白（Calreticulin，CRT）上调，瘤内TNF‑α（Tumor Necrosis Factor‑alpha）及IFN‑γ（Interferon gamma）升高，以WPRE为探针qPCR示瘤内CAR‑T滞留量约为PBS组6倍，凋亡相关基因表达上调。结论：CBP破坏肿瘤血管并重塑抑制性TME，促进CAR‑T细胞肿瘤浸润、存活及效应功能，诱导免疫激活与肿瘤细胞凋亡，是其协同增效的重要机制。
讨论部分总结：研究人员指出TROP‑2在TNBC过表达且为经临床验证靶点，但CAR‑T无抗体偶联药物（Antibody‑Drug Conjugate，ADC）的"旁观者效应（bystander effect）"，故受TROP‑2表达异质性影响更大，且存在正常上皮低表达致脱靶风险及抗原逃逸可能。CBP作为血管破坏剂可选择性破坏肿瘤新生血管、缓解缺氧、降低髓源性抑制细胞（Myeloid‑Derived Suppressor Cells，MDSCs）及调节性T细胞（Regulatory T cells，Tregs）浸润，克服实体瘤CAR‑T浸润障碍，与CAR‑T具互补优势。本研究发现CBP可能伴骨髓抑制，后续应优化纳米粒表面修饰、给药时机及CBP与CAR‑T回输间隔，并在免疫健全同源小鼠、人源肿瘤异种移植（Patient‑Derived Xenograft，PDX）模型扩大样本验证。局限性包括NTG小鼠无功能性适应性免疫、观察期较短未评估CAR‑T长期持久性与晚期毒性、每组样本量偏小。未来方向含双靶点/逻辑门控CAR‑T设计防抗原逃逸、引入安全开关、与免疫检查点抑制剂三联及与TROP‑2 ADC头对头比较等。
结论翻译（Conclusion）：TROP‑2已成为乳腺癌中有前景的治疗靶点。本研究表明，CBP与TROP‑2 CAR‑T疗法联用可在体外及体内有效抑制乳腺肿瘤增殖与转移，从而为推进实体瘤细胞治疗提供了支持性证据。
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