组织功能衰退和再生能力下降是多种慢性疾病的病理基础。基线水平的组织衰老机制研究面临重大挑战，因其涉及数十年的时间跨度和多因素起源。表观遗传改变被假设具有关键病因学作用，但尚不明确其为相关性抑或因果性，及其对特定年龄相关病理的贡献程度。本研究描述了一种表观遗传驱动的加速衰老综合征。研究人员证明Heyn-Sproul-Jackson综合征（HESJAS）中DNMT3A（DNA甲基转移酶3α，DNA methyltransferase 3α）功能获得性突变再现了年龄相关的DNA甲基化（DNA methylation, DNAme）增益，导致多谱系干细胞功能障碍，并在人类和小鼠中模拟了衰老的多个方面。研究人员还表明，谱系特异性基因区域的高甲基化可解释干细胞输出减少和谱系偏斜。因此，从孟德尔遗传病出发，研究人员将DNAme介导的干细胞功能障碍与具有医学重要性的年龄相关血液学、骨骼和代谢病理的病因联系起来，这些病理可能成为未来 therapies 的靶点。
老化和年龄相关疾病历经数十年发展且具有多因素起源，使其难以通过实验手段研究。标志性（Hallmark）衰老过程为理解年龄相关病理提供了框架，"表观遗传学改变"便是其中一种标志性过程，伴随DNA甲基化（DNA methylation, DNAme；包括甲基化增加和减少）在基因组中随年龄增长而出现。DNAme改变可能与年龄相关但无功能学意义，然而，暗示因果关联的间接证据包括：延长小鼠寿命的干预措施可减少与年龄相关的DNAme变化，诱导多能干细胞（induced pluripotential stem cell, iPSC）重编程亦具有类似效应。此外，统计学DNAme时钟能准确预测跨组织和跨物种的生物学年龄，其预测年龄与实际年龄的偏差可预测年龄相关发病率与死亡率（即生物学年龄），促使学界形成DNAme改变具有因果性的预设。然而，证明直接的因果关联仍然是该领域重要的未解问题，且DNAme改变在细胞水平的影响机制及其具体负责的衰老表型仍有待阐明。
年龄相关的DNAme增益（即DNA高甲基化）主要发生于多梳蛋白（Polycomb, PcG）修饰结构域（domain）。这些区域通常维持低甲基化状态，由多梳蛋白复合物、组蛋白去甲基化酶和DNA去甲基化酶共同作用，以抵消DNA甲基转移酶的甲基化效应。Heyn-Sproul-Jackson综合征（HESJAS）中也存在DNA高甲基化，该疾病由DNA甲基转移酶3α（DNMT3A）功能获得性突变（DNMT3AGOF）引起，表现为小头性侏儒症。这些突变破坏了PWWP结构域介导的与H3K36me2/H3K36me3标记染色质的结合，导致DNMT3A氨基末端区域与H2AK119ub相互作用增强，从而增强其向多梳蛋白标记区域的定位。HESJAS患者出现位于多梳蛋白标记DNA甲基化谷（DNA methylation valley, DMV）中的保守谱系决定基因的异常高甲基化，且这种高甲基化不在多能干细胞中出现，而以时间依赖性方式积累。
本研究建立了C57BL/6J背景的Dnmt3aW326R/+ HESJAS小鼠模型，W326R取代对应于多个人类病例中的同源残基。该小鼠模型从6月龄起显示存活期显著缩短（中位预期寿命12.8个月，约为C57BL/6J小鼠预期寿命26-29个月的一半），伴发产后生长发育迟缓、体重进行性下降、白内障、被毛状况恶化、脊柱后凸、夜间活动减少及探索行为异常阳性等衰老相关表型。显微计算机断层扫描（micro-CT）显示6月龄Dnmt3aW326R/+小鼠出现严重骨质疏松伴骨小梁显著丢失和骨脆性增加。代谢评估显示6月龄突变小鼠血浆胰岛素水平为野生型（wild-type, WT）对照的3倍，但血糖水平无差异，表明存在显著胰岛素抵抗，该现象在3月龄时已可通过稳态模型评估胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）检测到。血清脂联素浓度降低、肝脏脂肪变性及棕色脂肪组织"白化"提示脂肪组织功能衰竭为胰岛素抵抗的可能原因。这些代谢表型在普通饲料喂养条件下即可出现，而非需要高脂饮食诱导，且在两性中均呈进展性。造血系统方面，6月龄突变小鼠骨髓（bone marrow, BM）出现髓系偏斜，造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC）比例增加。
甲基化BeadChip分析显示，Dnmt3aW326R/+小鼠在出生4天后的骨髓、肠道和肝脏中即出现进行性DNA高甲基化，先于观察到的表型出现，且主要集中于多梳蛋白标记结构域和启动子区域。同一区域的DNA高甲基化在WT样本中也随年龄增长而出现，但水平低于突变组织。
研究人员聚焦于造血系统，发现Dnmt3aW326R/+小鼠骨髓总细胞数显著减少，成熟血细胞（淋巴细胞、髓系细胞和红细胞） depleted 最为严重，但长期HSC和多能祖细胞（multipotent progenitor, MPP）群体数量未减少，否定了"干细胞加速分化导致耗竭"的假说，转而考虑HSC功能受损为造血输出减少的原因。竞争性骨髓移植实验证实Dnmt3aW326R/+ HSC产生成熟血细胞的能力严重受损，且输出呈髓系偏斜（与Dnmt3a缺失突变HSC移植后的淋巴系偏斜相反）。分化商数（differentiation quotient）计算显示供体来源W326R/+ HSC的输出显著降低，是外周血重建失败的主要原因。反向移植实验（将WT HSC移植入亚致死照射的突变或WT受体）显示突变受体中移植HSC的植入率更高且无谱系输出差异，表明BM造血细胞输出减少和淋巴系 depleted 源于Dnmt3aW326R/+ HSC的细胞自主性功能障碍。体外集落形成实验进一步证实原代培养Dnmt3aW326R/+ BM细胞的各谱系祖细胞集落形成能力 diminished。
研究人员进一步评估肠道干细胞（intestinal stem cell, ISC）功能，发现Dnmt3aW326R/+单个隐窝细胞形成的肠道类器官（organoid）数量和大小显著减少；奥沙利铂化疗后肠道上皮再生能力明显受损，证实多谱系干细胞功能障碍至少存在于骨髓和肠道两种不同组织。
为探究DNA高甲基化对干细胞功能的影响机制，研究人员对FACS分选的HSC进行酶学甲基化测序（enzymatic methyl-seq, EM-seq），证实该成年干细胞群体存在多梳蛋白标记区域的广泛高甲基化——差异甲基化区域（differentially methylated region, DMR）的中位甲基化水平从WT的9.7%升至突变体的49.9%，且这些DMR强烈富集于含多谱系关键基因的多梳蛋白标记DMV。单CpG位点分析未发现衰老特征性部分甲基化结构域（partially methylated domain）的大范围低甲基化区域，确认Dnmt3aW326R突变导致HSC中多梳蛋白区域特异性高甲基化。
为评估高甲基化的转录后果，研究人员对骨髓造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cell, HSPC；Lin⁻ Kit⁺）进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）。结果显示WT与突变样本中干细胞和祖细胞群体相同，无突变特异性细胞簇，但差异丰度分析显示突变体后期祖细胞阶段显著减少，尤其是中性粒细胞和晚期红细胞祖细胞。命运轨迹分析显示Dnmt3aW326R/+细胞沿髓系和红细胞分化通路的晚期假时间点频率显著降低，提示分化程序延迟；多个DMR编码的谱系相关成熟标志物在晚期红细胞和中性粒细胞祖细胞中表达显著降低，与转录激活速率减慢一致。细胞周期分析未发现明显变化。
研究人员选择B淋巴细胞分化作为深入研究的范例。B淋巴细胞数量在HESJAS中受影响最为严重，其分化涉及多个转录因子，包括作为从pre-pro-B细胞向pro-B细胞转变关键调控因子的Pax5。Pax5启动子和调控区在Dnmt3aW326R/+ HSC中存在高甲基化，而传统观点认为启动子甲基化具有转录抑制作用。FACS分选的早期B细胞群体（Hardy分期）的RT-qPCR分析显示，WT pro-B细胞（Hardy B期）可 robust 激活Pax5转录，但Dnmt3aW326R/+ pro-B细胞该激活过程严重受损。pre-pro-B（Hardy A期）细胞数量正常，但pro-B和pre-B细胞（Hardy B-D期）显著减少，提示分化在此转换阶段受阻。此外，与Pax5促进远端V基因片段重组的功能一致，生产性V(D)J重组事件减少，剩余重组事件强烈偏向近端V基因使用。值得注意的是，虽然在Hardy A和B期细胞中DNA高甲基化明显存在，但在大多数Dnmt3aW326R/+ pre-B、未成熟和成熟B细胞（Hardy C-F期）中该甲基化显著消失，而中性粒细胞中Pax5高甲基化持续存在，其他B细胞基因座甲基化亦然，提示存在针对Pax5 DNA甲基化的选择性压力，即Pax5表达 least abrogated 的细胞才能通过pro-B至pre-B转换阶段存活。
研究人员进一步验证HESJAS高甲基化与生理性衰老的关联：小鼠Dnmt3aW326R/+高-DMR位点在老年WT小鼠中甲基化水平显著升高；人类新生儿、青年和百岁老人白细胞的公开全基因组亚硫酸氢盐测序（WGSB）数据再分析显示，多梳蛋白标记DMV的DNAme随年龄增长而升高；HESJAS高甲基化CpG位点在18,869名Generation Scotland（GS）队列个体中与年龄呈正相关，表现与Horvath泛组织DNA甲基化时钟所用CpG相当。基于HESJAS高-DMR CpG构建的DNA甲基化时钟在预测实际年龄方面与多种已发表时钟表现相当。现有时钟预测HESJAS患者和小鼠模型存在加速年龄，提示HESJAS和Dnmt3aW326R/+小鼠代表了正常年龄相关DNA高甲基化的加速和加剧模型。
综上所述，研究人员从DNMT3A功能获得性突变的孟德尔遗传病出发，建立了表观遗传驱动的加速衰老综合征模型，证实DNA高甲基化通过损伤多谱系干细胞功能导致年龄相关血液学、骨骼和代谢病理，为解析DNA甲基化改变与生理衰老的因果关系提供了实验证据，并为表观遗传重编程等抗衰老治疗策略的开发提供了临床前模型基础。
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