肺损伤表面巨噬细胞聚集促进胸腔内粘连（Intrathoracic Adhesion，IA）形成

编者按：胸腔内粘连（Intrathoracic Adhesion，IA）常使胸外科手术复杂化，增加术中出血、手术时间延长及术后漏气风险。此外，人为诱导IA的胸膜固定术（pleurodesis）在治疗自发性气胸中具有治疗作用，值得注意的是41.4%复发性气胸患者接受化学或机械胸膜固定术。因此，阐明IA形成的分子机制对优化手术管理与治疗干预至关重要。虽有小鼠心包粘连模型报道，但尚未建立简便的小鼠模型以探究肺组织与胸壁间粘连的分子机制及开发防治药物。本研究旨在建立简易IA小鼠模型评估病理改变，并识别肺与周围组织粘连早期预防性干预的潜在靶点。 图1a左展示粘连诱导剂注射的宏观图像。根据补充材料详述的评分法评估胸腔内三处位置的宏观IA分级。给药部位确定为左肺与胸壁间区域（标星号），透过膈肌可见。给药后9天，滑石（talc）处理小鼠左肺与邻近胸壁组织出现严重粘连，未观察到明显疼痛、痛苦或死亡。尽管小鼠纵隔薄且不完全，左右胸膜腔可能相通，左侧胸膜腔给予2 g/kg滑石可稳定诱导左肺与胸壁间可重复的胸腔内粘连。苏木精–伊红（Hematoxylin and eosin，H&E）、Masson三色染色及Ⅰ型胶原α1链（Collagen Type I Alpha 1 Chain，COL1A1）免疫组化染色显示，第9天肺组织与胸壁间检测到新生纤维层，以梭形细胞浸润及明显蓝色着色为特征。为确定显著肺粘连建立的转折点，研究人员在滑石给药后21天内评估并定量评分粘连程度。给药后第9天观察到明显IA形成且粘连评分显著升高，随后进入平台期；相反第3、6天仅见轻度粘连。结果表明肺损伤表面的细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）产生始于给药后第3天，肺组织与胸壁间连接性纤维组织于第9天完全形成，导致以高粘连评分为特征的强IA。该小鼠模型为阐明胸外科术后肺组织与邻近组织粘连的分子机制提供了有价值工具。 研究人员进一步通过bulk RNA测序（bulk RNA-sequencing）与空间转录组（spatial transcriptomics）比较IA形成前后的基因表达以探明机制。bulk RNA测序显示，与第0、3天相比第9天共407个基因显著上调、65个基因显著下调。其中按p＜0.05且|log2倍变（fold change）|＞1标准，纤维化相关标志物纤连蛋白1（Fibronectin 1，Fn1）、Col1a1、Ⅲ型胶原α1链（Collagen Type III Alpha 1 Chain，Col3a1）、骨膜蛋白（Periostin，Postn）及巨噬细胞标志物Cd68第9天显著升高。急性期（第3天）中性粒细胞标志物S100a9与S100a8表达较高；后期（第9天）ECM诱导及其产生相关基因如转化生长因子β1（Transforming Growth Factor Beta 1，Tgfb1）与热休克蛋白47（Serpin Family H Member 1，Serpinh1）上调。空间转录组结果显示，粘连诱导后第6天肺组织与胸壁粘连部位Col1a1与Cd68 mRNA呈高表达（图1b左箭头）。均匀流形近似与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP）分析揭示Col1a1（成纤维细胞标志物）表达模式与Serpinh1高度相似，表明Serpinh1可作为胶原产生细胞内标志，而Cd68表达模式不同于二者，提示免疫细胞特别是巨噬细胞可能促进Serpinh1阳性细胞招募及胶原产生，进而促成胸壁与肺组织粘连。免疫荧光染色显示CD68阳性巨噬细胞与Serpinh1阳性胶原产生细胞均定位于粘连组织内；CD68阳性巨噬细胞在粘连诱导急性期广泛聚集于胸壁与肺组织间，随后减少，而Serpinh1阳性细胞自第6天起增多并紧密接触于胸壁–肺界面。为明确CD68阳性巨噬细胞功能作用，研究人员注射氯膦酸盐脂质体（clodronate liposomes）予以清除。氯膦酸盐脂质体显著抑制小鼠IA形成，对照组脂质体处理小鼠则持续出现明显肺–胸壁粘连；且其显著降低粘连评分，并在CD68阳性细胞清除后明显抑制Serpinh1阳性胶原产生细胞聚集。这表明阻止肺表面巨噬细胞聚集是抑制粘连形成的关键干预点。研究结果与异物诱导肺纤维化依赖巨噬细胞及GATA6+巨噬细胞参与早期损伤反应影响后续粘连形成的证据相符。本研究建立的简易可重复小鼠模型结合分子谱分析，为阐明IA病理及加速预防药物开发提供强有力平台。但仍需进一步探讨该模型与人类病理差异及巨噬细胞在粘连部位聚集的机制。综上，损伤后巨噬细胞聚集于肺及胸壁表面并在粘连形成中起核心作用；成纤维细胞胶原产生为继发性事件，巨噬细胞是纤维化反应的起始驱动因素，其聚集先于并指导Serpinh1阳性成纤维细胞活化，触发ECM沉积及后续组织粘连。阐明调控巨噬细胞聚集的分子机制有望开发巨噬细胞导向策略，实现不依赖滑石制剂的可控粘连形成；巨噬细胞清除可减少Serpinh1阳性细胞及纤维化，从而抑制组织粘连。

本文对发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》的研究——Macrophage accumulation on the injured pulmonary surface promotes intrathoracic adhesions——进行解读总结。

研究背景与立项依据

胸腔内粘连（Intrathoracic Adhesion，IA）会增加开胸或胸腔镜手术的难度，易导致术中出血、操作时间延长及术后肺泡漏气；反之，有意诱导IA的胸膜固定术（pleurodesis）是治疗难治性自发性气胸的重要手段，约41.4%复发气胸患者需接受化学或机械胸膜固定术。目前虽有小鼠心包粘连模型报道，但尚缺乏简便、可重复的肺–胸壁IA小鼠模型来解析分子机制并筛选防治靶点。因此研究人员拟建立小鼠IA模型，描绘病理进程并寻找早期干预潜在靶点。

主要关键技术方法概述

研究人员建立C57BL/6小鼠左侧胸膜腔滑石（talc，2 g/kg）注入IA模型，设术后第3、6、9、14、21天终点；采用H&E、Masson三色染色及COL1A1免疫组化评估纤维化程度并按既定标准行宏观粘连评分。取D0、D3、D9胸膜组织行bulk RNA-seq，取D6粘连部位组织行10x Visium空间转录组测序，结合免疫荧光（CD68、SERPINH1）及免疫组化定量细胞聚集。部分小鼠于术前经氯膦酸盐脂质体（clodronate liposomes）腹腔/静脉给予以清除巨噬细胞，评估粘连抑制效果。统计学方法含Dunnett多重比较、Student t检验、Mann–Whitney U检验及Kruskal–Wallis检验。

研究结果

Establishment of an intrathoracic adhesion (IA) model in mice

将滑石注入小鼠左侧胸膜腔可稳定诱导左肺与胸壁间可重复粘连。组织学显示第9天出现典型纤维化层，粘连评分第9天达峰值并维持平台期，第3、6天仅轻度粘连，提示ECM合成启动于第3天、第9天完成纤维桥接，证实该模型可用于后续机制研究。

Integrated spatial transcriptomics and bulk RNA-seq analysis for unveiling the molecular mechanism underlying IA formation

Bulk RNA-seq示第9天纤维化标志物（Fn1、Col1a1、Col3a1、Postn）与巨噬细胞标志物Cd68显著上调，第3天中性粒细胞标志物（S100a8、S100a9）高表达，第9天Tgfb1与Serpinh1上调。空间转录组显示粘连部位Col1a1与Cd68共高表达；UMAP示Col1a1与Serpinh1表达模式重合（Serpinh1为胶原产生细胞内标志），Cd68表达模式分离，提示巨噬细胞可能招募并激活胶原产生细胞。

Macrophage accumulation on the surface of lung tissue prior to IA formation

免疫荧光与定量显示CD68阳性巨噬细胞于急性期（第3天）大量聚集于肺–胸壁界面，随后减少；SERPINH1阳性胶原产生细胞自第6天起升高并定位于同一界面，表明巨噬细胞聚集早于成纤维细胞活化。

Macrophage depletion effectively inhibits IA formation

氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞后，小鼠粘连评分显著下降，SERPINH1阳性细胞聚集受抑，证实肺表面巨噬细胞聚集是IA形成的关键始动因素，阻断其聚集可有效减轻粘连与纤维化。

讨论与结论翻译

本研究表明损伤后巨噬细胞先于成纤维细胞聚集于肺及胸壁表面，是启动ECM沉积与粘连形成的核心驱动因素；其通过指导Serpinh1阳性（胶原产生）成纤维细胞活化促进纤维化粘连。阐明调控巨噬细胞聚集的分子机制有望开发新型巨噬细胞导向策略，以实现不依赖滑石的可控胸膜固定或抗粘连预防。研究人员得出结论：肺损伤表面巨噬细胞聚集促进胸腔内粘连形成；巨噬细胞清除可减少Serpinh1阳性细胞及纤维化，从而抑制组织粘连。