摘要：自我扩增RNA（self‑amplifying RNA, saRNA）中基因表达的精确可逆控制仍较为困难，限制了这一本具潜力的平台在治疗学中的灵活性。虽然甲病毒（alphavirus）来源的saRNA编码可驱动RNA复制的非结构蛋白（non‑structural proteins, nsPs）并提供内在调控节点，但现有方法尚无法对该复制装置进行直接的小分子药物依赖型调控，以实现表达的高保真调节。本研究通过将药物响应性降解结构域（destabilization domain, DD）融合至各非结构蛋白，工程化saRNA构建体使其复制可由已获批小分子药物三甲氧苄氨嘧啶（trimethoprim, TMP）激活，从而调控自我扩增过程。由于各复制蛋白对RNA拷贝贡献不同，研究人员系统筛选了融合构型并确定了最优设计——将修饰后的复制蛋白与受调控的载荷（payload）基因组合。该构建体在开（on）与关（off）状态间实现了超过104倍的差异且关状态下背景表达可忽略。在小鼠模型中，口服TMP可实现可调、可逆及按时间程序化的表达模式。当编码人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）抗原时，递增的TMP给药方案增强了生发中心（germinal centre, GC）反应——抗体亲和成熟的关键决定因素。该药物调控saRNA平台为疫苗、免疫治疗及基因治疗提供了一种可控且与临床兼容的策略。
《Nature Biomedical Engineering》刊载的此项研究针对自我扩增RNA（self‑amplifying RNA, saRNA）缺乏高保真、可逆、小分子药物依赖型表达调控手段的瓶颈，提出并验证了通过融合药物响应性降解结构域（destabilization domain, DD，源自突变型二氢叶酸还原酶dihydrofolate reductase, DHFR）至甲病毒来源saRNA的非结构蛋白（non‑structural proteins, nsPs：nsP1–nsP4）复制装置，使saRNA复制本身受已上市抗生素三甲氧苄氨嘧啶（trimethoprim, TMP）调控，并结合载荷（payload）基因的DD融合，实现体内外高动态范围、低泄漏、可逆及时间可编程的基因表达控制，并在HIV抗原疫苗模型中证明递增抗原暴露可增强生发中心（germinal centre, GC）B细胞应答。
主要关键技术方法
研究人员以委内瑞拉马脑炎病毒（Venezuelan equine encephalitis virus, VEEV）TC‑83株来源saRNA为骨架，通过Gibson组装将TMP响应的DD分别融合至nsP1–nsP4及目的基因（gene of interest, GOI），体外转录合成Cap‑1型saRNA；脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）包封后体外电转或LNP转染细胞（C2C12成肌细胞/分化肌管、BHK‑21、KP肺癌细胞、HEK293T），以萤火虫荧光素酶（firefly luciferase, fLuc）或mCherry报告基因评估TMP依赖的表达及开关比；实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）检测saRNA基因组及亚基因组RNA拷贝数；四参数logistic（four‑parameter logistic, 4PL）模型拟合剂量‑响应曲线；BALB/c小鼠肌肉注射LNP‑saRNA并经含不同剂量TMP饲料口服给药，活体生物发光成像（In Vivo Imaging System, IVIS）纵向监测表达；免疫接种实验以HIV‑1 gp120衍生免疫原engineered outer domain‑GT8（eOD‑GT8, 简称eOD）为抗原，酶联免疫吸附测定（enzyme‑linked immunosorbent assay, ELISA）检测抗体滴度，流式细胞术分析引流淋巴结中T滤泡辅助细胞（T follicular helper cell, TFH）及GC B细胞频率与抗原特异性GC B细胞，干扰素‑γ酶联免疫斑点试验（IFN‑γ ELISpot）检测T细胞应答。
研究结果
Fusion of DD to nsPs effectively controls transgene expression from saRNAs
研究人员构建了单DD融合（分别至nsP1–nsP4或仅至GOI）及双/三DD融合（nsP‑DD加GOI‑DD或nsP2‑DD/nsP3‑DD组合）的saRNA文库，在C2C12、BHK‑21及KP细胞中转染评估。结果显示仅融合GOI‑DD泄漏严重（约5倍开关比）；nsP1‑DD降低开态表达；nsP2‑DD/nsP3‑DD单独融合有较高开态但泄漏明显；nsP4‑DD完全失活；nsP3‑DD/GOI‑DD达约70倍动态范围；nsP2‑DD/nsP3‑DD双nsP融合达210倍开关比，再加GOI‑DD进一步降低关态背景。流式细胞术确认最优线路（nsP2‑DD/nsP3‑DD/GOI‑DD及nsP3‑DD/GOI‑DD）在mCherry报告系统中关态几乎无检出信号，且对不同蛋白形式（胞内、分泌、跨膜）均有效，开态MFI仅较组成型saRNA低2倍但较非复制修饰mRNA（modified mRNA, modRNA）高10倍。剂量‑响应拟合支持nsP‑DD与GOI‑DD组件的乘法效应及模块化预测能力。
Regulated nsPs enable control of saRNA backbone and subgenomic RNA levels by TMP
qPCR分析表明nsP3‑DD及nsP3‑DD/GOI‑DD在关态时saRNA基因组及亚基因组RNA拷贝数较组成型降低超一个数量级，开态相当；nsP2‑DD/nsP3‑DD关态RNA水平更低，开态时两者均较组成型升高超两个数量级，提示nsP2‑DD融合在TMP稳定下可增强聚合酶活性或复制复合体装配效率；nsP1‑DD主要影响亚基因组转录而非基因组复制；nsP4‑DD严重破坏复制复合体功能致RNA水平大幅下降。
saRNAs with regulated nsP expression optimize gene expression control in muscle fibres
在分化C2C12肌管中LNP递送最优线路，显示与体外一致的TMP调控、最小毒性（≤100 ng/μL saRNA）及近5个数量级的开关差异。撤除或添加TMP可实现表达关/开切换；TMP浓度滴定显示表达在约0.1 μM TMP饱和，具剂量依赖性。
Regulated nsPs enable high‑fidelity control of payload gene expression in vivo
小鼠肌肉注射LNP‑saRNA后口服TMP饲料，质谱证实血浆TMP可调（2 mg/g饲料≈0.5 μM）。活体成像显示nsP1‑DD系开态低且有迟发泄漏；nsP2‑DD/GOI‑DD降低但仍有明显泄漏；nsP3‑DD/GOI‑DD泄漏低；nsP2‑DD/nsP3‑DD及nsP2‑DD/nsP3‑DD/GOI‑DD兼具强开态表达与极低关态背景（关态接近未注射对照）。剂量‑响应在体可调两数量级，最大表达在0.5 mg/g口服TMP；表达持续超1个月，DD调控不缩短saRNA持久性。动态切换（饮食换入/换出TMP）可关断或开启表达；递增、延迟开启及振荡TMP方案分别产生递增、延迟峰值及波动的表达曲线。肿瘤内注射于KP肺癌移植瘤同样实现TMP剂量依赖性调控。
Using regulated saRNAs to augment B cell responses to vaccination
以nsP2‑DD/nsP3‑DD/eOD‑DD saRNA编码HIV eOD抗原，体外验证TMP严格控制抗原分泌。小鼠免疫后，恒定高TMP与递增TMP（0.004→0.02→2 mg/g）组抗体滴度相似且高于低TMP组；但递增TMP组引流淋巴结中抗原特异性GC B细胞频率显著高于恒低或恒高TMP组，总GC B及TFH比例各组无差异，提示调控复制子主要通过调节抗原动力学改善GC质量（富集高频突变/高亲和力B细胞）而非单纯放大总体抗原特异或记忆B细胞池。非调控saRNA引发GC反应与恒高TMP组相当。T细胞ELISpot显示nsP3/nsP4肽库应答在恒高TMP组更高，递增方案因初期低复制酶表达略减抗nsP免疫。
讨论与结论
研究表明将DD融合至saRNA骨架nsPs尤其nsP2与nsP3组合，可通过TMP控制saRNA自身扩增实现高保真、可逆、时间可编程的基因表达，超越仅调控载荷蛋白稳定性的局限。nsP功能差异决定融合效果：nsP1干扰加帽及膜关联降开态；nsP2多功能（解旋酶、蛋白酶）致单独融合泄漏但TMP稳定后可增强复制复合体活性；nsP3 C端无序区适合融合得低泄漏中等开态；二者联用具协同效应；nsP4高度保守DD融合破坏RNA聚合酶活性。该平台在不同种属及细胞类型表现稳健，且与野生型saRNA共转时因复制泡（spherule）分隔维持独立调控，支持多载荷共递送。疫苗应用中递增抗原表达模式增强GC B细胞成熟质量，为难中和病原体疫苗设计提供新思路。未来可考虑非抗生素DHFR‑DD配体以避免耐药顾虑。综上，该研究建立了基于FDA批准小分子药物调控saRNA复制本身的RNA基因电路，允许体内数周高保真基因表达动力学控制，拓展了saRNA在疫苗、基因治疗及癌症治疗中的应用潜力。
