优化的样品制备对于利用单颗粒冷冻电镜（single-particle cryo-electron microscopy, cryo-EM）或在位冷冻电子断层扫描（in situ cryo-electron tomography, cryo-ET）在其天然状态下成像生物大分子复合物至关重要。在此研究人员提出EasyGrid——一种模块化、自动化的平台，旨在简化并标准化cryo-EM/ET样品制备流程。EasyGrid集成了载网（grid）在线等离子体（plasma）处理、微流控分配、无吸 blot（blot-less）样品铺展、基于射流的玻璃化（jet-based vitrification）以及利用光干涉法进行的载网质量控制（grid quality control）。研究人员通过制备多种纯化大分子复合物的载网并利用cryo-EM解析其结构，证实了该系统的有效性。此外，与传统投入式冷冻（conventional plunge-freezing）相比，EasyGrid实现了对大型哺乳动物细胞更优的玻璃化（vitrification）效果。通过实现系统性、高通量的参数优化，EasyGrid为结构生物学及细胞cryo-EM应用提供了一个稳健且省时的解决方案。
EasyGrid自动化冷冻电镜样品制备与质控平台的研究解读
《Nature Methods》刊发的此研究针对当前cryo-EM/ET样品制备依赖人工经验、重现性差、难以兼顾大体积细胞样品玻璃化及缺乏快速前置质控手段等瓶颈，开发了模块化全自动平台EasyGrid，并集成了基于数字全息显微术（Digital Holographic Microscopy, DHM）的低温冰厚测绘模块EasyGrid Control（EGC）。研究人员通过该平台完成了多种蛋白复合物高分辨率单颗粒分析（Single-Particle Analysis, SPA）及哺乳动物细胞原位cryo-ET的优质样品制备验证，证明其在提升制样质量、通量与可重复性上的显著优势。
主要关键技术方法
研究人员构建EasyGrid系统，包含：自动载网抓取与传输的三轴笛卡尔机械手；常压等离子体（plasma）亲水化处理模块；双喷头压电皮升（picoliter, pl）级微流控样品分配器（兼容96孔板，温控4–37 °C）；高湿（>85% RH）腔体内置气压波（pressure-wave）样品铺展装置（毫秒级双侧气流摊薄液膜，替代传统blot）；液乙烷（liquid ethane）对撞喷射玻璃化（jet vitrification）与液氮存储转盘；以及可选配的EGC模块——在液氮温度下利用马赫-曾德尔干涉光路采集全息图，相位解包裹获得纳米级冰光学厚度图。细胞实验采用光刻微图案化（micropatterned）SiO2 金载网培养HeLa及SUM159细胞，经压力波去除培养基后喷射冷冻，FIB-SEM减薄制Lamella，与Leica GP2 plunge-freezing对照比较冰晶率。
研究结果
EasyGrid modules automate sample preparation and quality control（EasyGrid各模块实现样品制备与质控自动化）
研究人员详细描述EasyGrid硬件架构：载网装载架→等离子体炬（~5–10 s往返扫过增强亲水性）→双压电喷头（~50 pl/滴，最高1000 滴/s，按预设图案如中线100滴线形沉积样品）→高湿腔内气压波喷嘴（生化样品典型30 ms，细胞样品300 ms去除培养基）→延时可调（最小200 ms）后送入乙烷对撞射流点完成玻璃化→存入带RFID追踪（eCryoID tag）的液氮气相存储转盘。EGC模块可独立或集成，利用DHM在–170 °C下以×2（全载网概览~5 min）或×10（拼接9×9图块~15 min）获取与cryo-EM Atlas一致的冰厚分布图，并经×2标定校正×10绝对厚度，验证了与电子断层扫描测厚的一致性，可批量预筛至多40枚载网。
EasyGrid provides high-quality samples for structural biology（EasyGrid为结构生物学提供高质量样品）
EasyGrid automates cryo-EM grid preparation for single-particle analysis（EasyGrid自动化SPA载网制备）
研究人员建立SPA流程：等离子处理→可选预涂（Blue Dextran等）→样品分配+气压波铺展+喷射冷冻。使用该流程制备人脱铁铁蛋白（apoferritin）、酿酒酵母核糖体（yeast ribosomes）、KR2细菌视紫红质五聚体（KR2 rhodopsin pentamer）、硝酸胍酶（guanidinase）及真菌染色质重塑复合物INO80–核小体复合物（INO80–nucleosome complex），经Titan Krios或Glacios采集数据，cryoSPARC/RELION处理后分别获得1.9 Å、2.4 Å、2.3 Å、3.0 Å及5.9 Å重建密度图，粒子取向分布良好。其中KR2 cryo-EM图谱较同期X射线晶体学揭示更多内部水分子及脂质排列差异，证明无blot的气压波铺展未引入高分辨信息损失。
EasyGrid improves cell vitrification quality for in situ cryo-ET（EasyGrid提升原位cryo-ET细胞玻璃化质量）
研究人员在微图案化金载网上培养HeLa细胞，EasyGrid流程为：取网格入高湿30 °C腔→1.8 bar气压波400 ms去除培养基→立即乙烷喷射冷冻（全程<40 s）。对比plunge-freezing组，FIB-SEM减薄Lamella后在TEM下观察及二维傅里叶变换（FFT）冰环峰值分析显示：EasyGrid组经训练人员校正后77±14%采样点为明确玻璃态（vitreous），plunge-freezing组仅11±24%。EasyGrid-vitrified HeLa细胞Lamella经倾斜序列（tilt series）采集与子断层平均（sub-tomogram averaging）获细胞质核糖体6.8 Å密度图，证实胞内超微结构保存完好，适用于in-cell高分辨cryo-ET。
讨论（Discussion）总结
研究人员指出EasyGrid的气压波铺展（数毫秒至数百毫秒）区别于慢速blot且不会吸附（leach）样品颗粒，兼容~2 Å SPA且适用于贴壁细胞制样；全自动化精确控制液滴量（±50 pl）、铺展-冷冻延迟（±1 ms）实现冰厚精细调控。EGC通过DHM实现非接触式低温冰厚测绘，未来将升级更高倍率光学以测单个孔（hole）冰厚并整合荧光与神经网络自动判读。EasyGrid支持类似蛋白质结晶的高通量条件筛选及未来扩展时间分辨混合与光触发反应捕获。该平台模块化设计允许单独部署EGC进行载网初筛或作为完整制样系统，助力cryo-EM/ET设施提升细胞喷射冷冻与生化样品优化效率，目前正评估用于纳米X射线成像的细胞样品玻璃化。
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