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反转录专题之一：如何选择反转录酶？ 反转录酶的选择考虑哪些因素？保真度，RNaseH 活性有无，反转录产物长度，灵敏性，耐热性和对付复杂模板的能力，反应产率，性价比......
反转录专题之二：热销反转录酶大盘点 Invitrogen有SuperScriptIII，Roche新推Transcriptor高保真，Promega，Qiagen，NEB，Takara，Stratagene，各有所长，还有不容错过的特价信息！
什么是反转录酶？
反转录酶，又称逆转录酶，是依赖于RNA模板的DNA聚合酶的统称。它们由反转录病毒编码，将病毒RNA基因组复制成DNA，再整合进宿主细胞中。由于这个过程中遗传信息是从RNA到DNA，正好与转录过程相反，故称反转录。逆转录酶是1970年美国科学家特明（H.M.Temin）和巴尔的摩（D.Baltimore）发现的，并因此获得1975年度诺贝尔生理学医学奖。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成出互补的DNA(cDNA)，可以由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，也可以通过PCR扩增得到特定的目标基因，这是基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。
反转录酶具有DNA聚合酶活性，可以单链RNA为模板利用dNTP从5’到3’反转录生成cDNA，反应需要引物来起始合成。通常反转录酶不具有3'→5'外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高（最新消息：罗氏新近推出了带有校正功能的高保真反转录酶，生物通将在本文随后介绍）。此外，反转录酶还有DNA指导的DNA聚合酶活性，可以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。另外，反转录酶带有RNase H活性，即从RNA-DNA杂合体上降解RNA单链活性。反转录酶的RNase H活性在实验室反转录过程中扮演了双重角色，一方面RNase H活性会降解RNA模板，影响反转录产物的长度和产量，不少商品化的反转录酶特意用突变技术改造酶去除了RNase H活性以期得到更多全长的反转录产物，提高产率；另一方面，逆转录反应结束后继的cDNA第二链合成或PCR实验需要借助RNase H活性以去除反应体系中的RNA模板，对于采用去除RNase H活性的反转录酶的实验往往需要另外添加RNase H。
所有的反转录病毒都有反转录酶，但市面上最常见的两种反转录酶就是MMLV和AMV，两种酶有相同的基本活性，但是在许多特性包括最适温度和最适pH值上却大相径庭。
l MMLV——Moloney murine leukemia virus（莫洛尼氏小鼠白血病毒），是单链多肽，84kDa，其聚合酶活性强，RNase H活性很弱，适用反应温度为37度。其基因工程产品纯度高。MMLV反转录酶的RNase H-突变体也比较常见，有利于合成较长片段cDNA，产率更高。另外通过基因工程手段改造可以得到耐热性达到55-60度的反转录酶，有利于解决RNA二级结构的问题。
l AMV——Avian myeloblastosis virus（禽成髓细胞瘤病毒），包含两条多肽链，具很强的聚合酶活性和RNase H活性。适用反应温度为42℃（鸡的正常体温），适用于二级结构较复杂的mRNA模板。
l 来源于Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许70度左右的高温反转录RNA，彻底消除RNA模板的二级结构对反转录造成的干扰。
反转录酶的一个重要作用就是将成熟的mRNA反转录成互补DNA（cDNA）。如右图所示，加入12-18个碱基的Oligo(dT)引物，它们与mRNA的polyA帽子结构互补，并起始反转录酶延伸合成第一链cDNA，可用于构建cDNA文库。如果采用基因特异的引物进行反转录，然后再用PCR扩增得到特定的DNA，也就是我们通常所说的RT-PCR。RT-PCR在克隆cDNA、快速诊断某种疾病等多个方面应用甚广。
如果选择反转录酶？
市面上有那么多种反转录酶，是不是让人眼花缭乱呢？不要紧，抓住几个关键因素，问题就迎刃而解啦。
产物长度和RNase H的活性：
生物通前文提到过，反转录酶自带RNase H活性，一方面有助于反应后降解RNA模板，另一方面也会影响产物的长度和得率。在全文库构建、或者需要克隆较长片段，或者未知长度的DNA时，要得到完整的产物，就需要优先关注反转录的产物长度，适合选择无RNaseH活性的逆转录酶，或者RNase H活性低的混合酶产品。特别是未知长度的基因，笔者听过多例因为逆转录酶产物长度不够长而误导实验结果的例子，当中的无解、反复和波折，真是大费周章。多个品牌提供的逆转录酶试剂盒的转录产物可长达12kb以上，甚至高达20kb。AMV和MMLV都有RNase H的活性，MMLV的RNase H活性比AMV弱。许多品牌都提供基因工程突变的MMLV，去除了RNase H活性，有利于获得更多全长的cDNA。对于已知较短片段，反转录活性高、适应性强的AMV也是不错的选择。
最适温度
一般的反转录酶在遇到mRNA复杂二级结构时往往会脱离模板，导致反转录无法有效继续，得不到长的反应产物。提高反应温度有助于消除模板的二级结构，增加反转录的特异性，减少错配。但是较高的反应温度可能导致酶工作效率的降低。AMV由于来源于禽类病毒，最适温度42度，耐受温度范围较宽，反转录活性强。而MMLV最适温度37度，经过基因工程的改造的热稳定MMLV可在较短时间（1-3.5hours）耐受50-60度反应温度，不过反应温度越高耐受期也越短。来源于高温环境下的嗜热细菌的反转录酶是耐热性最高的酶，可长时间耐受高达70度的反应温度，即使最困难的模板也可迎刃而解。因此，如果你的模板GC含量高或者具有复杂的二级结构，可根据情况选择热稳定的反转录酶在更高的温度（55-70℃）下反应能得到较好的结果。
灵敏性
如果你的模板量很少，比如来自珍稀物种极为珍贵的样品，比如最安全的无创产前基因诊断中从产妇外周血中筛选出胎儿核型细胞（进入母体血液的胎儿细胞量非常少）；比如用激光捕获显微切割(LCM)技术从组织冰冻切片中摘取的癌细胞，或者是显微镜下才可见的微小寄生生物，那么就要选择灵敏度高的反转录酶。反转录酶不断升级换代，检测起始模板的总RNA量的下限已低至pg级别，对高丰度管家基因甚至低到0.1pg起始总RNA即可检测到！对于样品量大的常规检测或者扩增，不必考虑灵敏性时，不妨选择反转录活性高适应性强的反转录酶。
保真度
反转录酶通常不具有3'→5'外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。这可能也是病毒变异性高适应性强的原因之一。现在已经有校对功能的高保真反转录酶推出，如果你想接着做表达和测序，高保真的反转录酶就是你的不二选择啦。
反应效率
一般来说，粗放、耐受性强的酶效率高，产率大，对于反应条件要求不高，很适合常规检测或者模板量大，长度较短的普通反转录实验。而高保真、高灵敏度或者高温反应可能会影响反应效率。不过现在流行组合酶，将几种不同的反转录酶混合以达到兼顾的效果。最短的反应时间已经从常规的1小时左右缩短到10分钟！在科研不断提速，追求更快出结果的今天，实在是实验人的好消息。
价格比
产品的价格是大家最关心的问题之一。对于逆转录酶，需要留意不同品牌的酶的单位定义不一定相同，有的产品每次反应需要用200U的酶，有的则为几个单位，“单位”内涵不同。评估每次反应的成本，需要以一个包装能做的反应次数为准来判断。另外，有些性能出众的好产品价格不菲，所以不妨留意促销活动，趁价格非常划算时，抓紧时间囤货。生物通也搜罗到最新的几个口碑产品强力特价信息，可留意下文。
顺便说说反转录反应中的三种引物吧，可能经常有人很困惑，不知道到底该用哪一种。
l Oligo(dT)：它同大多数真核细胞mRNA 3'末端poly(A)尾巴杂交。通常用于产生全长的cDNA。oligo(dT)12-18适用于大多数RT-PCR。
l 随机引物：也就是随机六聚体。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列或从带有二级结构区域的RNA模板获得cDNA。
基因特异引物（GSP）：它特异性地与目的mRNA杂交，特异性最高。这类引物通常用于诊断分析和快速鉴定某个基因。（未完待续）
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