一步法实现mRNA的分离和cDNA的合成

与RNA打交道本来就不是一件容易的事，更何况是mRNA。在RNA提取过程中，经常会遇到降解或DNA污染等问题。尤其是在沉淀和洗涤步骤，会损失相当多的mRNA。如果你的细胞足够多，那可能不算什么大问题，反正不差细胞。但如果你的细胞数目在两位数甚至个位数，高效的mRNA提取方法就显得相当重要了。

分离mRNA，不外乎都是利用poly A这个小尾巴。但磁珠有差异，结果自然分高下。德国美天旎公司以磁珠起家，MACS技术更是深入人心。50 nm的超顺磁化μMACS^TM微珠与细胞裂解物混合后，微珠立即与目的mRNA结合。随后过一个置于MACS分选器中的MACS柱子，磁性标记的mRNA即被分离纯化。逆转录可在同一个柱子中进行。彻底洗涤后，洗脱得到纯的cDNA。整个过程如图1所示。

图1. MACS技术用于一步法mRNA分离和cDNA合成的原理

从图1可以看出，mRNA纯化后无需洗脱下来，用μMACS^TM One-step cDNA试剂盒和thermoMACS^TM分选器，cDNA合成可直接在柱上进行。该分选器是永久磁铁，可被加热到37℃或者42℃。革命性的柱内cDNA合成大大的降低了mRNA和cDNA的损失。第一链合成后，不需要的组分被洗掉而cDNA留在柱内。这项独特的技术确保每个步骤如mRNA分离、cDNA合成和纯化都在同一个柱内进行，最大限度的保留了样本。因此，当起始样本数很小，如只有五个细胞时，仍然可得到可靠的cDNA合成。

MACS技术用于一步法mRNA分离和cDNA合成的其他优势：

• 高纯度：MACS®技术可实现完全的柱内清洗，得到优质的mRNA而不会有基因组DNA的污染。
  
• 高回收率：避免离心、缓冲液去除过程中的损失
  
• 可重复性好，结果可靠：一步法cDNA合成可很容易的实现自动化
  
• 速度快：从细胞、组织或者血液样本中得到mRNA只要15分钟。再需要75分钟即可得到合成好的并在同一个柱子上纯化好的cDNA。
  

如果你的样品不太多，可以选择以手动方式处理，那么你需要以下三大件：

1、 μMACS^TM Oligo(dT)微珠

• 超顺磁化的颗粒—只在磁场中才会有磁性
  
• 尺寸很小—直径只有50纳米
  
• 不会沉降，极高的反应动力—立即与目的mRNA结合
  

    优点：出色的敏感性—mRNA可从极少的样本中分离出来，甚至单个细胞

2、 MACS®柱子

• 填充有铁珠，可增强磁场—滞留结合目的mRNA的纳米大小的μMACS微珠
  
• 缓冲液由重力作用自然流过，因此不需要离心和缓冲液去除步骤。避免损失
  
• 彻底的洗涤过程
  

    优点：高回收率，高纯度

3、 MACS®分选器

• MACS®分选器是永久磁铁。可加热的thermoMACS^TM分选器（图2）是专为柱中进行如cDNA合成这样的酶反应而设计的。一步法避免了管与管之间移液造成的损失。
  

    优点：高回收率

图2. thermoMACS^TM分选器可被加热到37℃或者42℃

客户反馈：德国马尔堡大学的Mack认为“它相当可靠，而且能产生大量的超纯产物。与其他技术相比，在磁珠分离的所有样品中都未检测到基因组DNA的扩增。”

当然，如果你有几十个甚至上百个样品，也很容易将该流程放大在96孔板上进行，并用MultiMACS 96分选器进行分选。只需要45分钟，即可从细胞和组织中平行地进行多样本的mRNA纯化。结合机械加样系统，可以实现整个流程的完全自动化。另外，还有可加热的MultiMACS^TM 96thermo分选器可供选择，因此一步法mRNA分离和cDNA合成可被放大到完全自动化的，平行的96样本处理，并拥有MACS技术的所有优势。

客户反馈：瑞士苏黎世理工学院的Wolfrum教授谈到：“我们通常处理几十个样品。现在，有了MultiMACS 96thermo分选器，我们能够平行进行最多96个样品的cDNA合成，节省了大量的时间和经费。”