CRISPR-Cas9 编辑潜藏风险揭秘：基因组大片段插入不容忽视！

CRISPR-Cas9 基因编辑在学术和临床广泛应用，但其潜在遗传毒性风险，如大片段插入（LgIns）研究不足。研究人员通过多种实验，分析不同供体及编辑方案下的 LgIns 情况。结果发现 LgIns 普遍存在，且供体磷酸化可降低风险。该研究为安全使用 Cas9 编辑工具提供关键见解。

在基因编辑领域，CRISPR-Cas9 技术就像一把神奇的 “分子剪刀”，能够精准地切割 DNA，为生命科学研究和临床治疗带来了无限可能。它被广泛应用于学术研究、生物技术开发以及临床治疗等多个方面，帮助科学家们探索基因的奥秘，也为攻克一些疑难杂症带来了新希望。然而，这把 “剪刀” 在使用过程中，真的像我们想象的那么安全吗？

随着 CRISPR-Cas9 技术逐渐走进临床应用，人们越来越担心它可能带来的潜在风险。之前的研究已经发现，该技术可能会导致脱靶突变，就像是射箭时没有射中靶心，反而射到了其他地方。除此之外，还有研究表明它会产生一些意想不到的基因变化，比如非随机的大片段和复杂结构变异、单核苷酸变异增加以及杂合性频繁缺失等。但是，这些研究大多是在没有供体模板的情况下进行的。在实际的基因编辑操作中，供体模板起着重要作用，它就像一个 “模板指南”，引导细胞按照我们的期望对基因进行修改。可不同类型的供体序列对 Cas9 介导的基因编辑结果有什么影响？Cas9 诱导的意外大片段插入（LgIns）情况究竟如何？这些问题就像一团迷雾，一直困扰着科研人员。为了拨开这团迷雾，来自阿卜杜拉国王科技大学（King Abdullah University of Science and Technology，KAUST）的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Communications Biology》杂志上，为我们理解 CRISPR-Cas9 技术的潜在风险提供了重要线索。

研究人员主要运用了两种关键技术方法。一是长读长测序技术 IDMseq（Individual Molecule DNA sequencing），它能给原始目标 DNA 加上独特分子标识符（UMIs），就像给每个 DNA 分子贴上了独一无二的 “小标签”，这样就能对 Cas9 编辑后的细胞中数万个等位基因进行分析，检测出频率低至 0.004% 的各种变异类型 。二是牛津纳米孔技术（ONT）测序，通过这种技术对编辑后的基因位点进行测序，获取详细的基因信息。研究中使用的样本是人类胚胎干细胞（hESCs），这些细胞为研究提供了重要的实验材料。

Cas9 编辑不同类型供体模板导致多样突变谱

研究人员精心设计了三种用于同源定向修复（HDR）的供体模板，分别是单链寡脱氧核苷酸（ssODN，130 nt）、线性双链 DNA（dsDNA，180 bp）和环状双链 DNA（dsDNA 作为质粒，3197 bp），目的是在 EPOR 基因的最后一个外显子中引入 chr19:11,378,195 C>T 点突变。他们把这些供体模板和野生型酿脓链球菌（S.p.）Cas9 核糖核蛋白（RNP）用电穿孔的方法导入 H1 hESCs 细胞中。结果发现，环状 dsDNA 与 S.p. Cas9 RNP 共转染会导致大量细胞死亡，所以后续实验使用了细胞毒性较低的 Alt-R® S.p. HiFi Cas9 与环状 dsDNA 模板进行实验。

对编辑后的细胞进行 IDMseq 分析后发现，在 ssODN 和线性 dsDNA 样本中检测到了预期的点突变，频率分别为 10.06% 和 0.72%，而环状 dsDNA 样本中没有检测到。同时，所有编辑样本中的新生单核苷酸变异（SNVs）显著增加，且这些 SNVs 在 C>T（G>A）转换中富集。在结构变异（SVs）分析方面，未添加供体模板（OnlyCut）的样本中，10.94% 的等位基因在 EPOR 靶区域存在大片段 SVs（>30bp） 。有 ssODN 和线性 dsDNA 供体时，大片段 SV 等位基因频率分别为 8.66% 和 9.86%，环状 dsDNA 样本中该频率较低，为 1.37%。而且，不管供体类型如何，大多数 SVs 都是缺失。研究还发现，Cas9 编辑时存在模板会显著降低大片段缺失的频率，但却意外地增加了 LgIns 的频率。

对 Cas9 编辑等位基因的单分子定量分析揭示大片段插入情况

IDMseq 技术让研究人员能够对长度超过 30bp 的 Cas9 诱导 LgIns 进行定量分析。在编辑后的细胞中检测到了许多插入片段，这些插入片段都在 Cas9 切割位点附近（±200bp），大部分紧邻切割位点。在未添加供体模板的样本中，检测到 52 个（0.43%）长度在 32 - 629bp 的 LgIns。当有供体模板存在时，使用 ssODN 和线性 dsDNA 进行 Cas9 编辑的样本中，LgIns 频率分别增加到 0.79% 和 1.61%。

研究人员进一步探究插入 DNA 的来源，发现未添加供体模板样本中，大多数插入 DNA 是独特的，96.15% 能与人类 hg38 参考基因组比对上，但都不与假定的脱靶位点重叠。25% 的插入 DNA 来自 Cas9 切割位点附近区域（±2kb），其余分别来自靶染色体的远端区域（23.08%）或其他染色体（48.08%）。有趣的是，还检测到两个无法与已知核苷酸序列比对上的插入 DNA，这表明在 Cas9 编辑过程中可能通过易错的 DNA 修复机制产生了新的序列。

Cas9 诱导大片段插入的功能分析揭示插入 DNA 的基因组热点来源

通过对插入 DNA 和编辑区域进行多序列比对，发现它们之间没有明显相似性。利用 RepeatMasker 数据库注释发现，未添加供体模板样本中，大量插入 DNA（46.15%，不包括切割位点 ±2kb 区域内的）来自基因组重复区域，这些区域包含散布重复序列和低复杂性 DNA 序列。其中，逆转座子元件（REs），如长末端重复序列（LTRs）、长散在核元件（LINEs）和短散在核元件（SINEs）占重复序列的 86.21% 。所有插入的 LINEs 都是截断的，且大多数是 LINE1 元件（87.5%）。通过卡方检验发现，各种 RE 插入的观察值与预期值接近，说明 RE 插入的普遍性可能是随机的，意味着 DNA 修复机制在基于 DSB 的 Cas9 编辑过程中随机获取了基因组片段。

研究人员还发现，未添加供体模板样本中，38.46% 的插入 DNA（不包括靶位点 ±2kb 区域内的）位于 FANTOM5 转录起始位点（TSS）峰、ENCODE 候选顺式调控元件（cCREs）和 H3K27Ac 峰附近（±1kb） 。而且，76.92% 的插入 DNA 位于基因座中，还检测到一些来自蛋白质编码区域和 TSS 的插入。在多个基因座的编辑实验中都发现了蛋白质编码序列和 TSS 序列的整合，这揭示了基于 DSB 的 Cas9 编辑存在普遍且被忽视的风险。

模板指导的 Cas9 编辑导致全长或串联多聚体双链 DNA 供体整合

以往研究表明，ssODN 供体可实现高效 HDR，本研究也发现 ssODN 能减少 H1 hESCs 中的大片段缺失。但 ssODN 与 Cas9 RNP 共递送会使意外 LgIns 频率增加 1.8 倍，且大多数插入来自宿主基因组。与 ssODN 不同，线性 dsDNA 样本中 69.78% 的 DNA 插入来自供体本身，其中 12.95% 的插入接近全长，6.47% 包含头对尾串联多聚体供体序列。使用环状 dsDNA 作为供体时，LgIns 频率降低，且大部分插入来自宿主基因组。研究还构建了 CircularHITI 供体进行实验，发现存在质粒骨干序列插入和目标截断插入的情况。

供体 DNA 磷酸化可减少意外 SVs 且不影响 HDR 效率

研究中使用的线性 dsDNA 供体是未经 5′磷酸化的 PCR 扩增产物。研究人员用 5′磷酸化的线性 dsDNA（LinearDsDNA^phos）进行实验，发现它与普通线性 dsDNA 在安装预期点突变时编辑效率相似，说明 DNA 磷酸化不影响 HDR。但 LinearDsDNA^phos能降低 LgIns 频率，且在减少 LgIns 的同时，提高了 LgIns 中供体整合的比例。此外，使用磷酸化供体时，所有类型的意外大片段 SVs 频率都降低了，如大片段缺失频率下降。这表明供体磷酸化是模板指导的 Cas9 编辑中提高安全性的有效方法。

研究结论表明，CRISPR-Cas9 编辑会导致平均等位基因频率为 0.7%（范围 0.1 - 1.61%）的意外 LgIns，这些 LgIns 来源多样，包括逆转座子元件、调控元件和外显子序列等，可能带来多种风险，如影响基因功能、导致癌症发生等。不同供体模板在 Cas9 编辑中各有特点，ssODN 效率高且副产物少，而线性 dsDNA 存在较多意外的全长和双链供体整合情况。供体 DNA 磷酸化可有效减少意外 SVs，同时不影响 HDR 效率，为提高 Cas9 编辑安全性提供了可行策略。

这项研究首次详细分析了 Cas9 编辑诱导的意外 LgIns，揭示了其潜在风险，为安全使用 Cas9 编辑工具提供了重要依据。在未来的基因编辑研究和临床应用中，科研人员和医生需要更加谨慎地评估和监测这些风险，合理选择供体模板和优化编辑方案，确保基因编辑技术能够安全、有效地造福人类。