基于中性pH（6.8）肉汤微量稀释法可靠测定结核分枝杆菌临床分离株吡嗪酰胺最低抑菌浓度的新策略

本文推荐一种在中性pH（6.8）条件下，利用肉汤微量稀释法（broth microdilution）测定吡嗪酰胺（PZA）对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）临床分离株最低抑菌浓度（MIC）的创新方法。该方法克服了传统酸性测试条件导致的假耐药性高、重现性差等局限，通过荧光生长指示技术提升了检测的准确性与可靠性，为结核病（TB）治疗、耐药性监测及耐多药结核病（MDR-TB）的防控提供了更优的解决方案。

引言

吡嗪酰胺（Pyrazinamide, PZA）是现代结核病（Tuberculosis, TB）治疗方案中的关键药物，尤其因其能将结核病疗程从9-12个月缩短至6个月而备受重视。然而，对PZA耐药性的误诊可能导致治疗失败、不良预后以及耐药菌株的产生。日益增长的PZA耐药性对治疗成功构成威胁，凸显了进行可靠药物敏感性试验（Drug Susceptibility Testing, DST）的迫切需求。

药物敏感性试验主要分为表型和基因型两种。表型DST被视为金标准，它通过培养结核分枝杆菌临床分离株，并在抗生素存在下评估其生长抑制情况，根据临床折点（如CLSI和EUCAST标准）将分离株分类为敏感（S）、中介（I）或耐药（R）。基因型DST则基于分子技术，能够快速预测耐药菌株，但其依赖于已知的耐药机制和先进的生物信息学技术。

PZA的DST面临独特挑战。与其他结核药物不同，PZA在常规培养基的中性pH下对结核分枝杆菌无活性，需要在酸性（pH 5.0–5.5）或碱性（pH 8.5）条件下才具有体外活性。目前的PZA表型药敏试验在pH 5.9下采用宏量稀释法进行，但该方法存在结果不可靠、假耐药率高以及无法使用微量稀释或比例法等局限性。这些技术挑战导致表型PZA药敏试验在临床实验室中并未常规开展。

PZA是一种前体药物，需要由结核分枝杆菌的吡嗪酰胺酶（Pyrazinamidase, PZase）激活，该酶由pncA基因编码。尽管pncA基因突变导致的PZase活性丧失是PZA耐药的明确机制，但某些多态性及新出现的突变并不导致PZA耐药。此外，基于PZase活性检测或pncA基因测序的方法无法捕捉由PZA靶基因突变引起的耐药机制。这些复杂性使得PZA药敏预测成为结核病药物中最具技术挑战性的方面之一。

近期研究表明，PZA在确定培养基的中性pH 6.8条件下表现出抗结核活性，这为在中性pH（最适合结核分枝杆菌生长的条件）下进行标准化的PZA最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）测试提供了可能性。MIC定义为在标准化孵育条件下能够抑制微生物生长的最低抗菌药物浓度，通常以μg/mL表示。在临床实践中，肉汤微量稀释法通常依赖于半定量测量（如可见生长抑制）来确定MIC。对于分枝杆菌，也可采用基于荧光的生长指示剂（如氧传感器）来监测微生物生长。

本研究评估了一种基于中性pH（6.8）肉汤微量稀释法，通过抑制可见生长或利用荧光生长指示来确定一组经证实具有PZase活性的结核分枝杆菌临床分离株的PZA MIC。研究结果证明了该方法的可行性和可靠性，有望成为常规PZA药敏试验和耐药性监测的有力工具。

材料与方法

结核分枝杆菌临床分离株

本研究共纳入25株非耐药的、经证实PZase阳性的结核分枝杆菌临床分离株，这些菌株来源于BEI资源。参考菌株结核分枝杆菌H37Rv ATCC 27294用作对照。此外，还测试了三种PZA耐药菌株（Z6、Z78和ORA136），它们均是结核分枝杆菌H37Ra的衍生物，分别携带PncA（L159P或C138R）或PanD（E126*）突变。

肉汤微量稀释法

PZA药敏试验使用干式96孔PZA DST板（pH 6.8）进行。简要步骤如下：从不超过4周菌龄的7H10或7H11琼脂平板上获取新鲜培养物，初始悬浮于含有5.0 mL/L甘油和0.025%（体积/体积）Tween 80的PZA DST缓冲液中。将悬浮液调整至0.5麦氏浊度标准，然后在同一缓冲液中按1:50稀释制备最终接种物。向PZA DST板的每个孔中接种200 μL稀释后的细菌悬浮液，最终接种密度约为每孔1.0–5.0 × 10⁵ CFU/mL。PZA测试浓度范围为12.5至800 μg/mL，共11个浓度，并设无药对照。平板用无菌密封膜密封，在37°C下孵育。在孵育期间，使用镜面盒在自然光下评估可见生长，或在黑暗背景下使用395–440 nm LED激发光检测荧光。对于含有氧传感器的孔，荧光由嵌入硅树脂中的氧猝灭荧光染料产生，细菌生长消耗氧气，解除猝灭，从而在紫外光下产生可见荧光，直接反映细菌生长。当无药对照孔显示充分生长，且对照菌株的MIC在预期参考范围内时，试验视为有效。MIC定义为与无药对照孔（显示生长/强荧光）相比，未见可见生长或荧光的最低PZA浓度。

结果

可见生长与荧光读数在中性pH（6.8）PZA MIC测定中的一致性

为评估可见生长和荧光读数在PZA MIC测定中的一致性，使用同一批稀释的参考菌株结核分枝杆菌H37Ra菌悬液，在含有或不含氧传感器（作为分枝杆菌生长指示剂）的PZA DST板上进行肉汤微量稀释试验。在第16天使用镜面盒评估生长。在无PZA对照孔中观察到附着于孔底的可见生长，在12.5 μg/mL浓度下观察到部分生长，而在25 μg/mL浓度下未见可见生长，因此根据可见生长将PZA的MIC定义为25 μg/mL。

在第10天使用410 nm LED光源在镜面盒中评估荧光。无PZA对照孔的荧光显著增强，在12.5 μg/mL时荧光减弱表明生长轻微（氧消耗减少），在25 μg/mL时未检测到荧光，表明生长被完全抑制（无氧消耗），与浊度结果一致，从而确认PZA的MIC为25 μg/mL。

这些发现表明，在中性pH条件下，使用PZA DST板对结核分枝杆菌H37Ra进行MIC测定时，基于可见生长和基于荧光的方法结果完全一致。重复实验得到一致的MIC值，支持了两种检测方法用于PZA药敏试验的稳健性和可重复性。所有试验均有效，因为无接种对照平板中未见生长，确认无污染。

使用含分枝杆菌生长指示剂的干式PZA DST板测定结核分枝杆菌临床分离株的PZA MIC

为评估中性pH干式PZA DST板的可行性和可靠性，我们测试了来自BEI资源的25株结核分枝杆菌临床分离株。这些分离株最初于1995年至2008年间从美国德克萨斯州的人体肺部或肺外样本中收集，被归类为具有PZase活性的非耐药菌株。此外，还测试了参考菌株H37Rv以及PZA耐药突变株Z6、Z78和ORA136。测试的临床分离株的PZA MIC范围从≤12.5到100 μg/mL。值得注意的是，25株分离株中有20株（80%）的PZA MIC ≤25 μg/mL，表明在中性pH 6.8条件下具有高度敏感性。另有4株分离株（16%）显示出中介MIC值为50 μg/mL，仅有1株分离株（4%）的MIC为100 μg/mL，表明可能对PZA的敏感性降低。H37Rv参考菌株的PZA MIC为25 μg/mL。相比之下，携带PncA L159P突变的PZA耐药菌株Z6的MIC显著升高至800 μg/mL。同样，PZA耐药菌株Z78和ORA136的PZA MIC也为800 μg/mL，证实了它们在这些测定条件下的耐药表型。对菌株HN2925和参考菌株H37Ra的0.5麦氏浊度细菌悬浮液进行CFU计数，结果分别为2.24 × 10⁷ CFU/mL和1.72 × 10⁷ CFU/mL，符合使用肉汤微量稀释法进行可靠抗结核药物（如利福平和异烟肼）MIC测定的标准接种量。

获得可解释MIC结果的周转时间在10至31天之间。大多数分离株（76%）在15天内产生有效读数，证明了该测定方法在临床或研究及其他环境中具有及时报告的潜力。

讨论

本研究证明，可以使用中性pH（6.8）下的肉汤微量稀释法可靠地测定PZA MIC，这是解决当前PZA DST方法局限性的重要一步。传统PZA DST所需的酸性条件虽然为PZA活化所必需，但会抑制结核分枝杆菌生长，并且即使在标准化条件下，也与高假耐药率和差的重现性相关。据报道，在当前的酸性PZA测试条件下，假耐药率可能超过20%，这严重损害了测试的可靠性。此外，这些方法通常仅在耐药群体比例≥10%时才能检测到，远高于大多数抗生素DST推荐的1%阈值，以防止治疗失败。由于PZA需要酸性活性，CLSI、EUCAST和WHO目前不推荐在结核分枝杆菌中使用肉汤微量稀释法进行PZA测试。这些局限性导致表型PZA测试被排除在常规临床实践之外。

我们的研究结果表明，PZA在确定的肉汤系统中于中性pH下仍保持可测量的活性，并且可以使用标准化接种物和肉汤微量稀释法方案一致地测定MIC。所使用的接种量符合结核分枝杆菌DST的既定指南。基于荧光的氧传感器通过检测耗氧量来反映代谢活性，为量化分枝杆菌生长提供了优于传统600 nm光密度（OD₆₀₀）测量的可靠替代方案。虽然OD₆₀₀是衡量如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等分散良好生物体细胞密度的可靠指标，但它不适用于结核分枝杆菌。结核分枝杆菌疏水、富含分枝菌酸的细胞壁在液体培养基中促进颗粒状、絮凝状聚集和索状形成，导致OD₆₀₀读数与活菌密度之间呈非线性关系。为克服这些局限性，可将基于荧光的生长指示剂整合到96孔板格式中，从而开发高通量、自动化的抗菌药物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Testing, AST）平台。本研究中测试的所有25株临床分离株均经证实具有PZase活性。其中，MIC范围从≤12.5到100 μg/mL，表明PZA敏感性存在差异。敏感的参考菌株H37Rv的MIC为25 μg/mL，而PZA耐药的Z6、Z78和ORA136菌株（分别携带PncA L159P、PncA C138R和PanD E126*突变）的MIC为800 μg/mL，从而证实了该方法的区分能力。这一发现表明，与当前酸性条件下的PZA DST相比，中性pH下的PZA DST可能提供与治疗结果更好的相关性。本研究中，在结核分枝杆菌PZA DST的肉汤微量稀释法中使用荧光读数被证明具有成本效益且用户友好。

尽管PZase活性是PZA敏感性的主要决定因素，但其单独存在并不能完全预测MIC水平。在PZase阳性菌株中观察到的MIC变异性支持了在基因型检测之外进行表型测试的必要性。此外，该方法可能允许检测细微的耐药表型，并支持未来定义临床相关PZA折点的努力。这种方法与用于其他结核药物的现有DST框架相一致，并具有在研究机构和临床环境中更广泛实施的潜力。最终，中性pH下的标准化MIC测试可以提高PZA耐药检测的准确性，减少假耐药判定，并支持更有效的治疗决策。该方法也可作为定义PZA特异性临界浓度和解释类别[S/I/R]的平台，从而推进全球结核病耐药性监测。

总之，本研究提出了一种在中性pH（6.8）下的标准化肉汤微量稀释法，作为测定结核分枝杆菌PZA MIC的可靠且可重复的方法。通过解决当前酸性pH测试的关键局限性（包括假耐药和重现性差），该方法提高了PZA药敏评估的准确性。结果支持其在临床和监测环境中的潜在应用。未来需要使用野生型临床分离株进行大规模验证，以确定可靠的PZA临界浓度并建立标准化的解释类别（S/I/R），最终提高PZA在结核病治疗中的临床效用。