通过工程化激素交互作用提高水稻血清素/褪黑素水平：基于ABA-5-HT信号通路的新策略

本刊推荐：为解决主食作物营养强化与产量平衡的难题，研究人员开展了水稻激素信号与血清素(5-HT)/褪黑素(MT)生物合成调控机制研究。研究发现脱落酸(ABA)通过转录因子ABI5激活限速酶基因TDC1/3和T5H的表达促进5-HT合成，而5-HT通过调控PP2Cs-SAPK2-ABI5磷酸化级联对ABA信号产生负反馈抑制。基于此交互机制，研究成功培育出12个5-HT/MT含量显著提高且产量稳定的水稻新种质，为功能性主食开发提供新策略。

在追求可持续健康的全球背景下，提高主食作物的营养价值已成为农业科学的重要课题。血清素(5-HT)及其衍生物褪黑素(MT)作为多功能的生理调节剂，在改善睡眠、缓解焦虑和免疫调节方面展现出巨大潜力。然而，通过膳食补充剂直接摄入这些物质存在潜在副作用和高成本等问题，而从植物中获取5-HT/MT则具有更好的生物活性和安全性。水稻作为全球主要粮食作物，提高其5-HT/MT含量对改善人类营养健康具有重要意义。

传统上，通过过度表达限速酶基因(如TDC1或TDC3)来提高5-HT/MT水平往往会导致植株生长受阻和育性下降，这严重限制了其应用价值。因此，探索新的调控机制，实现在不影响产量的前提下提高水稻中5-HT/MT含量，成为当前研究的重点和难点。

本研究发表在《Nature Communications》杂志，系统揭示了脱落酸(ABA)与5-HT代谢途径之间的复杂交互作用，并基于此开发了营养强化且产量稳定的新型水稻种质。研究人员发现ABA能显著诱导5-HT的生物合成，这一过程依赖于转录因子ABI5的调控，并受到PP2Cs-SAPK2-ABI5相互作用的负反馈调节。特别值得注意的是，5-HT能够调节ABA介导的PP2C活性，从而影响SAPK2的磷酸化，进而降低ABI5的磷酸化和转录活性，最终减弱ABA信号级联。SAPK2的T162和T283残基在调节ABI5磷酸化中发挥关键作用。

基于ABA与5-HT之间的交互作用，研究团队成功开发了多个5-HT/MT水平提高且不影响谷物产量的水稻品系。这些工程化水稻品系为提高水稻营养价值和促进健康食品生产提供了新途径。

主要关键技术方法包括：利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)定量分析植物激素和代谢物含量；通过酵母双杂交(Y2H)、双分子荧光互补(BiFC)和分裂荧光素酶互补(SLC)等技术验证蛋白质相互作用；采用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除突变体；运用电泳迁移率变动分析(EMSA)和CUT&Tag技术研究转录因子与DNA结合特性；通过体外磷酸化/去磷酸化实验分析激酶活性；利用双荧光素酶报告基因(DLR)系统评估转录调控活性。所有水稻材料均来源于中国水稻研究所的武运粳7号背景。

ABA诱导5-HT的生物合成

研究人员首先通过LC-MS分析发现，ABA处理24小时内能显著提高5-HT及其衍生物MT的水平。进一步分析表明，色胺水平在此期间显著增加，而色氨酸水平先下降后上升，提示ABA可能促进了色氨酸向色胺的转化，从而增强了5-HT/MT的生物合成。qPCR结果显示，ABA处理后，5-HT生物合成途径中的关键基因TDC1、TDC3和T5H被显著诱导，而直接参与MT合成的基因未表现出一致性诱导。这一发现通过ABA诱导的差异表达基因(DEGs)分析得到证实，表明ABA主要通过上调5-HT途径的相关基因(特别是TDC1/3和T5H)来增强5-HT/MT生物合成。

ABI5介导ABA诱导的5-HT生物合成

通过酵母单杂交(Y1H)筛选，研究人员发现bZIP10(ABI5)与TDC1/3和T5H启动子区域结合亲和力最强。CUT&Tag技术分析在TDC1和TDC3启动子区域鉴定到两个T-box和两个A-box motif，在T5H启动子区域发现两个ABA响应G-box motif，这些序列与已知的ABI5结合位点重叠。EMSA实验证实了ABI5与这些调控基序的特异性结合。DLR assays证明ABI5作为转录激活因子调控TDC1/3和T5H基因的表达。

研究人员利用CRISPR/Cas9系统构建了ABI5敲除突变体(CR-abi5)，并开发了Ubi::ABI5过表达植株。qPCR分析显示，Ubi::ABI5植株中T5H和TDC1/3的转录水平提高，相应地，5-HT/MT浓度也显著升高。相反，在CR-abi5突变体中，ABA诱导的T5H和TDC1/3表达明显减弱。这些结果表明ABI5参与调控水稻中5-HT水平，进而影响ABA介导的5-HT合成。

5-HT减弱ABA信号传导

研究发现5-HT/MT的过度积累会导致相关生物合成基因的显著下调，表明存在反馈调节机制。重要的是，5-HT合成的反馈调节与TDC1/3和T5H基因的抑制相关，而这些基因均被ABA处理强烈诱导，提示5-HT的反馈调节可能部分通过ABA信号通路介导。

RNA-seq分析显示，ABA单独处理共鉴定到7142个DEGs，而与5-HT共处理时，DEGs数量减少至5618个，特别是上调基因数量显著减少(2422/3615)。进一步分析发现，ABA响应信号通路的富集程度显著降低，表明5-HT减弱了ABA信号传导。

5-HT拮抗ABA介导的生理过程

研究人员通过研究种子萌发和叶片衰老这两个与ABA密切相关的生理指标，发现5-HT在这两个过程中产生与ABA相反的效果。10μM ABA显著降低种子发芽率和叶绿素含量，而10μM 5-HT处理则表现出促进生长作用。浓度效应分析显示，ABA浓度与种子发芽率呈负相关，而5-HT在1-10μM浓度范围内促进发芽。

外源5-HT处理和内源5-HT水平升高均能减轻ABA介导的萌发抑制和衰老过程。与单独ABA处理相比，5-HT共处理显著提高种子发芽率，并在ABA胁迫下改善叶绿素保留。这些结果表明5-HT信号拮抗ABA依赖性途径，并调节ABA介导的生理响应。

5-HT调节ABA诱导的PP2Cs-SAPK2复合物形成

在ABA信号级联中，ABA与PYR/PYL/RCARs传感器模块结合，抑制2C型蛋白磷酸酶(PP2Cs)活性，从而释放SNF1相关激酶2(SnRK2s)。Y2H筛选发现PP2C49与SAPK2、SAPK8、SAPK9和SAPK10存在相互作用，PP2C30、PP2C49、PP2C51均与SAPK2相互作用。SLC和BiFC实验进一步验证了SAPK2与PP2C30/49/51在烟草中的相互作用，Co-IP和体外pull-down实验在体内外证实了它们的相互作用。

研究发现10μM ABA显著增强PYL5与PP2C30/49/51的相互作用，而ABA与5-HT共处理明显减弱这种相互作用，表明5-HT可能通过干扰ABA诱导的PYL5-PP2C复合物组装来拮抗ABA信号。

PP2Cs-SAPK2介导ABI5磷酸化

SAPK2表现出强烈的自磷酸化活性。PP2Cs与SAPK2在大肠杆菌中共表达显著降低SAPK2磷酸化水平，体外去磷酸化实验证实PP2C30/49/51负调控SAPK2自磷酸化。通过Y2H、Co-IP、体外pull-down、SLC和BiFC实验验证了SAPK2与ABI5的相互作用。

激酶活性实验显示，SAPK2能显著提高ABI5磷酸化水平，而PP2Cs与SAPK2和ABI5共表达时，未检测到明显的ABI5磷酸化，表明PP2Cs抑制SAPK2驱动的ABI5磷酸化。这些结果支持5-HT通过可能的PP2Cs-SAPK2-ABI5相互作用调节ABA信号传导。

SAPK2 T162/T283决定ABI5磷酸化

LC-MS/MS鉴定出SAPK2的10个自磷酸化位点。体外激酶实验发现SAPK2^T159A/T162A突变体完全丧失自磷酸化活性，其中T162A单点突变足以抑制SAPK2磷酸化，而T159A突变无此效应，表明T162位点在调节SAPK2自磷酸化活性中起重要作用。

SAPK2^T283A突变体对ABI5的磷酸化活性显著降低，SLC、Co-IP和体外pull-down实验一致显示T283A突变减弱了SAPK2与ABI5的相互作用，强调T283磷酸化在介导SAPK2与ABI5相互作用及后续磷酸化中的关键作用。

5-HT抑制ABA诱导的ABI5磷酸化

外源5-HT处理和内源5-HT水平升高的转基因植株均显著降低ABA诱导的ABI5磷酸化。5-HT处理虽不显著改变ABI5转录水平，但明显降低ABI5蛋白水平，表明ABI5磷酸化可能影响其蛋白稳定性。体外细胞降解实验显示，SAPK2磷酸化的GST-ABI5在野生型水稻幼苗总蛋白提取物中降解速度慢于非磷酸化形式，ABA处理24小时后ABI5蛋白稳定性显著高于未处理对照。

工程化5-HT/MT富集水稻且不牺牲产量

基于ABA与5-HT代谢途径的交互作用，研究提出了两种提高水稻籽粒5-HT/MT水平且不影响产量的工程策略：一是通过靶向ABA代谢相关基因增加内源ABA浓度；二是靶向核心ABA信号传导以减弱5-HT介导的负反馈调节。

研究人员开发了12个转基因水稻品系，包括Ubi::OsNCED1-5过表达系、CR-OsABA8ox1-3突变体、Ubi::OsSAPK2过表达系、Ubi::OsABI5过表达系、CR-OsPP2C51突变体以及Ubi::OsABI5/CR-OsPP2C51双转基因系。分析显示，75%的转基因品系5-HT含量显著增加，其中75%的品系MT积累也同步增加。大多数转基因品系在分蘖数、千粒重、每穗实粒数和单株产量等农艺性状上无显著变化，实现了营养强化与产量稳定的平衡。

研究结论与讨论部分强调，该研究系统阐明了ABA与5-HT代谢途径之间的动态调节平衡，发现ABA通过ABI5转录激活限速基因TDC1/3和T5H促进5-HT合成，而5-HT通过拮抗PYL5-PP2C复合物形成，影响SAPK2磷酸化状态，从而减少ABI5磷酸化和ABA信号传导，实现对5-HT生物合成的反馈抑制。基于这一交互机制，研究成功培育出多个5-HT/MT含量提高且产量稳定的水稻新品系，为功能性主食作物开发提供了创新策略。

该研究的创新性在于首次揭示了植物激素与营养代谢物之间的精细调控网络，并巧妙利用这一机制解决了作物营养强化与产量平衡的长期难题。通过多基因协同调控策略，成功打破了传统代谢工程中常见的负反馈限制，为其他功能性农产品的开发提供了重要参考。未来研究将进一步优化转基因品系，利用分子辅助育种技术筛选生物利用度最佳的单倍型，最终实现水稻营养价值的全面提升，为人类健康膳食提供新解决方案。