1. 引言
神经母细胞瘤（Neuroblastoma, NB）是一种起源于神经嵴的胚胎性恶性肿瘤，几乎只发生在儿童早期。尽管它是一种相对罕见的疾病，但却是儿童中最常见的颅外实体瘤，也是儿童癌症相关死亡的主要原因之一。高危神经母细胞瘤具有显著的生物学异质性，其特点是频繁发生化疗耐药，这严重限制了治疗效果。因此，识别新型抗神经母细胞瘤药物仍然是一个紧迫且未满足的医疗需求。
分子杂交（molecular hybridization）是药物化学中广泛用于药物发现的一种技术，它将两个或多个生物活性实体的结构基序连接到一个单一的分子框架中，旨在复制原型分子的原始特性，或协同作用于与癌症相关的相同或不同生化途径。鉴于神经母细胞瘤中经常观察到由自由基产生引起的细胞氧化还原平衡改变，本研究旨在通过分子杂交具有内在抗氧化活性的天然骨架（香豆素、香兰素和异香兰素）来设计和合成新型抗增殖物质。
香豆素（2H-色原-2-酮）是一种由苯环和2-吡喃酮环组成的双环杂环，是类黄酮类植物次生代谢产物的一部分。香豆素衍生物是一类广泛的天然和合成化合物，显示出多种药理活性，包括抗炎、抗氧化和抗癌作用。另一方面，香兰素（4-羟基-3-甲氧基苯甲醛）和异香兰素（3-羟基-4-甲氧基苯甲醛）是广泛研究的芳香醛，具有作为抗癌剂的潜在用途。
酰肼-腙部分（-CO-NH-N=CH-）在本研究的杂合分子中充当连接子。腙通常由肼与醛或酮缩合而成，其生物活性可归因于其作为席夫碱（Schiff base）的性质，能够与分子靶标建立氢键。此外，几项研究已经调查了C-3位带有酰肼基团的香豆素的可能用途，强调了酰肼-腙部分作为抗肿瘤剂活性化合物的重要结构特征。
基于这些前提，本研究合成了17种新化合物，这些化合物由香豆素片段（3-羧基香豆素，未取代或可能在8位被OH或OCH3基团取代）通过酰腙连接子连接到香兰素或异香兰素或其苯氧基或苄氧基衍生物上。为了评估这些新化合物的生物学潜力，研究人员在几种神经母细胞瘤细胞系（HTLA-230、IMR32和SK-N-AS）以及多药耐药（MDR）细胞系（ER-HTLA-230）中评估了它们的效果。
2. 材料与方法
2.1. 化学合成
所有新化合物的合成均通过分子杂交策略完成。首先，通过丙二酸二乙酯与水合肼反应制备中间体A（乙基3-肼基-3-氧代丙酸酯）。然后，通过香兰素或异香兰素与相应的卤代物（如碘苯、苄氯、4-氟苄氯）反应，合成了一系列带有不同取代基（苯氧基、苄氧基、4-氟苄氧基）的醛类中间体B1-B6。中间体A与醛类中间体B1-B6（或3,4-二羟基苯甲醛用于合成中间体C7）在乙醇中回流反应，得到线性酰腙中间体C1-C7。最后，中间体C1-C7与相应的2-羟基苯甲醛（即香豆素-3-羧酸）在哌啶催化下缩合，得到最终的目标化合物1-17。所有最终化合物均通过薄层色谱（TLC）、熔点、元素分析和核磁共振（1H NMR和13C NMR）进行表征，纯度均高于95%。
2.2. 生物活性评价
2.2.1. 细胞培养与处理
实验使用了恶性神经母细胞瘤细胞系（IMR32、HTLA-230、SK-N-AS）以及多药耐药细胞系（ER-HTLA-230）。非恶性细胞系包括人角质形成细胞（HaCat）和小鼠胚胎成纤维细胞（3T3）。细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中培养。细胞用20 µM的化合物1-17处理72小时，以筛选活性化合物。对于活性化合物5、9、12和17，进一步进行了剂量依赖性实验以计算IC50值。
2.2.2. 细胞活力测定
使用MTS法评估细胞活力/增殖。将细胞接种在96孔板中，处理后加入MTS试剂，孵育1小时后在490 nm波长下测量吸光度。
2.2.3. 活性氧（ROS）产生
使用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针检测细胞内ROS水平。处理后，细胞与DCFH-DA孵育，通过荧光强度变化评估ROS产生量。
2.2.4. 脂质过氧化（LPO）测定
使用Image-iT™脂质过氧化试剂盒检测脂质过氧化。该试剂盒利用BODIPY™ 581/591 C11试剂的氧化来检测活细胞中的脂质过氧化。
2.2.5. 细胞衰老检测
使用CellEvent衰老绿色检测试剂盒检测衰老细胞。该试剂盒通过检测衰老相关的β-半乳糖苷酶活性来识别衰老细胞。
2.2.6. 克隆形成实验
将细胞以低密度接种在6孔板中，处理72小时后更换为无药培养基，继续培养20天。固定并结晶紫染色后，计数含有超过50个细胞的集落。
2.2.7. 蛋白质印迹（Western Blot）分析
通过蛋白质印迹分析检测聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的裂解情况，以评估细胞凋亡。
2.2.8. 铁死亡（Ferroptosis）机制研究
为了探究铁死亡是否参与化合物作用机制，细胞与铁死亡抑制剂（ferrostatin-1, liprostatin-1）或诱导剂（RSL3, erastin）共同处理，然后评估细胞活力。
2.2.9. 选择性指数（Selectivity Index, SI）计算
选择性指数（SI）通过非恶性细胞（HaCat或3T3）的IC50值除以恶性细胞（HTLA、ER、SK-N-AS、IMR32）的IC50值计算得出。
2.2.10. 药代动力学性质预测
使用SwissADME软件预测化合物的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）性质。
3. 结果与讨论
3.1. 化学合成与表征
成功合成了17种新型香豆素-香兰素/异香兰素杂合酰腙（化合物1-17）。1H NMR谱图显示，所有目标化合物均以E-异构体形式存在，并且由于N-酰腙连接子存在几何立体异构现象，在室温下表现为两种旋转异构体（rotamer）的混合物。通过变温核磁共振实验证实了这种旋转异构体的存在，随着温度升高，信号逐渐靠近并合并。
3.2. 自由基清除活性
通过DPPH法测定了化合物的抗氧化活性。结果显示，大多数化合物没有表现出很强的自由基清除活性，这主要是由于香兰素或异香兰素部分的羟基被官能团化所致。相比之下，化合物17保留了未修饰的儿茶酚基团，显示出较高的自由基清除活性。这表明，该基团对于直接的抗氧化活性至关重要。
3.3. 生物学结果
3.3.1. 化合物5、9和12能够选择性抑制癌细胞生长
在20 µM浓度下处理72小时后，化合物5、9和12能够显著降低HTLA-230及其多药耐药株ER细胞的活力（分别降低10-15%和20-25%），而对非恶性角质形成细胞HaCat的活力没有影响。相比之下，化合物17虽然能降低ER细胞的生长，但能刺激HTLA和HaCat细胞的增殖。
3.3.2. 化合物5、9和12刺激神经母细胞瘤细胞中ROS的过度产生
机制研究表明，化合物5、9和12能够诱导HTLA和ER细胞中ROS的过度产生（分别增加30%和35-40%），而在HaCat细胞中没有变化。特别是化合物12，在ER细胞中诱导了50%的ROS水平增加。这表明，这些化合物可能通过破坏癌细胞的氧化还原平衡来发挥抗增殖作用。
3.3.3. 化合物5、9、12和17不诱导凋亡性死亡
蛋白质印迹分析显示，化合物5、9、12和17处理后的细胞中，未检测到PARP的裂解片段，表明这些化合物不通过诱导细胞凋亡来杀死细胞。
3.3.4. 化合物5、9、12和17不诱导脂质过氧化和铁死亡
脂质过氧化检测结果显示，只有化合物17能够轻微增加ER细胞中的脂质过氧化（+10%），而化合物5、9和12反而降低了HTLA细胞中的脂质过氧化。此外，铁死亡抑制剂（ferrostatin, liprostatin）不能逆转这些化合物的细胞毒性作用，而铁死亡诱导剂（erastin, RSL3）与这些化合物联合使用时，也没有表现出协同作用。这些结果表明，这些化合物的抗增殖作用不依赖于铁死亡途径。
3.3.5. 化合物5、9和12通过诱导衰老来降低神经母细胞瘤细胞的生长
细胞衰老检测结果显示，化合物5、9和12能够诱导HTLA细胞中衰老阳性细胞增加50%，在ER细胞中分别增加40%（5和9）和25%（12）。而化合物17则没有诱导两种神经母细胞瘤细胞群的衰老。这表明，诱导细胞衰老是这些化合物发挥抗增殖作用的关键机制。
3.3.6. 化合物5通过降低细胞克隆形成潜能来减少细胞生长
克隆形成实验进一步证实了化合物的抗增殖效果。结果显示，只有化合物5能够显著减少HTLA和ER细胞集落的形成，而化合物17仅在HTLA亲代细胞中表现出类似效果。这表明化合物5具有更强的抑制肿瘤细胞长期增殖和再生能力的作用。
3.3.7. 化合物5、9和12对神经母细胞瘤细胞具有显著的选择性
通过计算选择性指数（SI），发现化合物5、9和12对神经母细胞瘤细胞表现出显著的选择性。特别是化合物9，在ER细胞中的SI值达到约8-13，在IMR-32细胞中达到25-39。化合物12在ER、SK-N-AS和IMR-32细胞中也显示出较高的选择性（SI ≈ 13-14）。这表明这些化合物对癌细胞具有较好的靶向性，而对正常细胞的毒性较低。
3.4. ADME性质预测
通过SwissADME软件预测了化合物的药代动力学性质。所有化合物均不违反Lipinski五规则，分子量低于500，LogP低于4.15，氢键供体和受体数目在合理范围内。拓扑极性表面积（TPSA）均低于140 Å2。预测结果显示，所有化合物均具有较高的胃肠道吸收率，且不是P-糖蛋白（P-gp）的底物。生物利用度评分为0.55，表明这些化合物具有良好的口服生物利用度潜力。
4. 结论
本研究成功设计、合成并评价了17种新型香豆素-香兰素/异香兰素杂合酰腙。研究结果表明，分子杂交是一种有效的策略，可以产生能够调节氧化应激和靶向其他抗肿瘤途径的新分子。化合物5、9和12能够通过诱导细胞衰老和ROS过度产生，选择性地抑制神经母细胞瘤及其多药耐药细胞的生长，同时保护健康细胞。这些化合物具有良好的药物相似性和选择性，为开发针对高危神经母细胞瘤的新型治疗策略提供了有前景的先导化合物，值得进行深入的临床前研究。
