带虫Cephalothrix cf. simula粘液与吻部蛋白质毒素的首次蛋白质组学解析及其捕食机制研究

本刊推荐：本研究首次对高毒性带虫Cephalothrix cf. simula的粘液与吻部进行了蛋白质组学（HPLC-MALDI-TOF/TOF-MS/MS）分析，鉴定出组织特异性分布的蛋白质/肽类毒素。结合qRT-PCR及透射电镜（TEM）实验，揭示了伪刺丝囊（pseudocnidae）在毒素递送中的关键作用，为理解纽动物化学防御与捕食的协同进化提供了新见解。

蛋白质毒素在带虫Cephalothrix cf. simula粘液与吻部中的发现

Cephalothrix cf. simula 是一种属于古纽虫纲（Palaeonemertea）的高毒性带虫，以其体内高浓度的河豚毒素（Tetrodotoxin, TTX）而闻名。近年来对纽动物门（Nemertea）的转录组学和蛋白质组学研究表明，该门所有纲的物种都拥有多样化的蛋白质和肽类毒素，这些毒素与吻部和表皮上皮的单细胞腺体相关。尽管此前的研究已在 C. cf. simula 的转录组中发现了大量推定的毒素，但相应的蛋白质组学数据一直缺失。本研究首次采用高效液相色谱-串联质谱法（High-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry）对 C. cf. simula 的粘液和吻部蛋白质组进行了全面分析。

摘要

本研究在 C. cf. simula 的吻部鉴定出三种推定毒素，在粘液中鉴定出三种。此外，在粘液中发现了四种、在吻部发现了一种具有推定毒性活性的富含半胱氨酸的肽（Cysteine-rich peptides, CRPs）。通过实时定量PCR（Quantitative real-time PCR, qRT-PCR）对相应基因在这两种组织中的表达进行了量化。吻部和粘液的毒素组成显示出明确的功能特化迹象，没有重叠的毒素，并且基因表达具有组织特异性模式。结合透射电子显微镜（Transmission electron microscopy, TEM）的摄食实验证实了特化的吻部结构——伪刺丝囊（pseudocnidae）在将毒素递送到猎物体内的作用。

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   引言

纽动物，或称带虫，是一类主要为底栖的海洋无脊椎动物，其生物学特性与生物活性分泌物的产生密切相关。纽动物门目前分为三个纲：古纽虫纲（Palaeonemertea）、有帽幼虫纲（Pilidiophora，包括Hubrechtiiformes和异纽虫纲Heteronemertea）以及针纽虫纲（Hoplonemertea）。尽管运动能力有限且身体柔软，大多数纽动物是广食性捕食者，食谱包括环节动物、甲壳动物、软体动物和其他纽动物。纽动物承受的捕食压力相对较低，因为它们很少被典型的底栖捕食者（如鱼类和十足目甲壳动物）取食。

为了有效捕获猎物和进行防御，纽动物依赖于机械和化学适应的结合。机械适应包括用于捕获猎物的可外翻的吻部 apparatus 以及促进环境互动和保护的大量粘液分泌。化学适应涉及储存在吻部和表皮上皮腺细胞中的毒素。单针和复针针纽虫使用位于吻部中央的特化钙化刺或针突（stylet）来刺伤猎物并注入毒素。相比之下，古纽虫和有帽幼虫纲（除某些属外）的吻部含有杆状分泌颗粒，称为伪刺丝囊，其内包裹着一个中空的、线状的管状结构（核心），被认为能够外翻并穿透猎物的表皮。然而，迄今为止，尚未有伪刺丝囊在捕食过程中释放的确切案例报道。

对纽动物毒素的研究始于1960年代末，当时发现了影响烟碱型乙酰胆碱受体的吡啶衍生生物碱，包括众所周知的阿纳巴新碱（anabaseine）和纽默特林（nemertelline）。吡啶生物碱仅在针纽虫纲中被发现。随后，河豚毒素（TTX），一种电压门控钠通道的有效阻断剂，在几种纽动物中被报道。尽管TTX及其类似物存在于所有纽动物纲中，但大多数证据来自栖息在日本和俄罗斯水域的 Cephalothrix simula s.l. 物种复合体中的古纽虫。第一种导致小龙虾麻痹的多肽神经毒素于1980年代在异纽虫纲 Lineus 属中被观察到。迄今为止，所有物理分离和生化鉴定的纽动物来源的肽毒素，包括溶细胞素A II-IV、神经毒素B I-IV、α-nemertides 和 parborlysins，均来自有帽幼虫纲。

最近的基因组学、转录组学和蛋白质转录组学研究表明，所有纲的纽动物都拥有多样化的推定蛋白质和肽类毒素。分子进化分析表明，纽动物毒素库的形成经历了广泛的基因复制、新功能化和正选择，一方面导致毒素家族的谱系特异性扩张，另一方面则保留了高度保守的结构支架。许多毒素家族表现出趋同进化的特征，与节肢动物、刺胞动物、软体动物和脊椎动物的毒素共享结构基序、结构域架构或功能特征。相比之下，纽动物特有的抑制性半胱氨酸结（Inhibitor cystine knot, ICK）肽和溶细胞素强调了纽动物分泌系统的生化新颖性和药理学潜力。然而，大部分推定的纽动物毒素仍未得到注释和功能表征。

本研究聚焦于古纽虫 Cephalothrix cf. simula，它是 C. simula s.l. 物种复合体中的一个隐存种。该复合体中的物种以其高浓度的TTX而著称，而该群体中的其他毒素研究甚少。在Vlasenko等人的研究中，对 C. cf. simula 的转录组进行了测序，揭示了大量推定毒素转录本，包括酶类、离子通道抑制剂、孔形成毒素、蛋白酶抑制剂、神经毒素、影响止血的毒素和其他毒素候选物，其中离子通道抑制剂是表达量最高的组别。本研究对来自日本海的 C. cf. simula 的粘液和吻部进行了比较蛋白质组学分析，鉴定了候选的蛋白质和肽类毒素，表征了具有推定毒性活性的富含半胱氨酸的肽，并量化了其编码基因在两种组织中的表达。结合透射电子显微镜进行了摄食实验，以研究伪刺丝囊在纽动物捕食过程中毒素注射的作用。这些发现为理解纽动物分泌物的功能分化和生态作用提供了新的见解。

1. 2.
   结果

为了进行蛋白质组学分析，研究人员分析了分别来自四个不同 C. cf. simula 标本的四个吻部样本和六个粘液样本。分析使用先前发表的 C. cf. simula 转录组作为蛋白质鉴定的参考数据库。分析使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间/飞行时间（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight, MALDI-TOF/TOF）质谱仪进行了十次独立运行。在吻部中，共鉴定出360种蛋白质和肽，其中大部分是胞质或膜相关蛋白，而50种被预测为细胞外蛋白或含有信号肽。这些包括一种肽（<100个氨基酸）和49种蛋白质，其中39种是通过UniProtKB数据库注释的。根据UniProt注释，该数据集包括12种酶、10种膜/粘附蛋白、7种结构蛋白、5种调节/信号蛋白、2种丝氨酸蛋白酶抑制剂、1种组蛋白、1种核糖体蛋白和1种蜈蚣型毒液神经毒素。

在 C. cf. simula 的粘液中，共鉴定出35种蛋白质和5种肽，其中23种蛋白质和5种肽被预测含有信号肽。大多数序列与已知序列没有显著相似性。在10种注释的蛋白质中，2种是信号蛋白，2种是结构蛋白，1种是管家代谢酶，2种是酶类毒素，3种对应于同一种孔形成毒素。

研究人员使用ConoServer对来自 C. cf. simula 粘液和吻部的富含半胱氨酸的肽进行了进一步分析。仅考虑成熟肽长度不超过100个氨基酸、预测有信号序列且至少含有四个半胱氨酸残基的肽。最终从粘液中筛选出四个候选肽（ORF|114503, ORF|035733, ORF|002160, ORF|001398），从吻部筛选出一个（ORF|020829）。所选肽均没有与已知序列匹配的UniProt注释。粘液肽ORF|114503和ORF|035733被归类为半胱氨酸框架XXV（C–C–C–C–C–C），ORF|002160被归类为框架IX（C–C–CC–C–C）。吻部肽ORF|020829和粘液肽ORF|001398与任何已知的芋螺毒素框架都不匹配。在Vlasenko等人分析的12种纽动物转录组中搜索同源序列，发现所选肽的推定直系同源物仅存在于 Cephalothrix hongkongiensis 的转录组中。使用Jalview v2.11.5.1进行的配对比对显示相应序列之间具有较高的氨基酸同一性（84.4–100%）。

使用Phyre2预测了所选肽的三级结构，并与已知肽进行比较以评估结构相似性和潜在功能关系。粘液肽ORF|114503和吻部肽ORF|020829获得了高置信度（>80%）的预测结果，分别与神经毒素I（置信度85.1%；覆盖度48%）和MU-AGATOXIN-I（置信度86.9%；覆盖度57%）相似。粘液肽ORF|035733与一种抗高血压、抗病毒蛋白对齐（置信度75.6%；覆盖度35%），而ORF|001398和ORF|002160分别与TRPV1抑制肽Tst2（置信度44.3%；覆盖度56%）和一种金属蛋白酶抑制蛋白（置信度43.9%；覆盖度39%）相似度较低。使用UCSF Chimera v1.19将ORF|114503和ORF|020829的预测结构与其最接近的蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）模板进行结构比对。可视化和叠加显示，两种CRPs都采用了与其各自模板相似的保守二硫键稳定的核心折叠，但在外围环区和末端片段观察到显著差异。

还使用CSPred v 1.1预测了所选肽的推定功能类别。粘液肽ORF|035733和ORF|002160被归类为抗菌肽，概率得分>0.8。粘液肽ORF|114503被预测为离子通道阻断神经毒素，概率为0.71。另外两个肽无法被CSPred分类。为了进一步评估ORF|035733的抗菌潜力，在UCSF Chimera中检查了其分子表面特性。静电表面分析揭示了扩展的带正电荷区域，这与优先与带负电荷的微生物膜相互作用的阳离子抗菌肽一致。疏水表面图谱识别出离散的疏水斑块，表明其具有适合膜插入和破坏的两亲性结构。对于模板匹配置信度低的肽（ORF|001398和ORF|002160），结构解释有限，因此未进一步研究。

通过qRT-PCR测量了编码所选肽的基因在 C. cf. simula 表皮和吻部中的表达水平，以肌动蛋白（actin）作为参考基因。所有粘液肽基因在表皮中的表达均高于吻部，尽管上调程度不同。ORF|001398和ORF|035733基因在表皮中的表达量约为吻部的3倍，而ORF|002160和ORF|114503的表达则显著增强，分别提高了27倍和652倍。相比之下，ORF|020829在吻部中的表达量是表皮的6倍。

Malykin等人曾在光学水平上观察了 C. cf. simula 捕食多毛类的行为。在本研究中，当探测到猎物后，纽动物外翻其吻部，吻部沿着猎物体表移动并缠绕其上，形成盘绕。吻部在猎物表面留下了一条粘液痕迹，该痕迹一直保留到猎物被完全消耗。攻击后，纽动物缩回吻部，并爬行到部分或完全麻痹的猎物上开始取食。

利用透射电镜，研究人员细化了光学观察结果。完整多毛类的表皮由单层上皮细胞覆盖角质层（厚2.5–3.8 µm）和上皮表层（约2 µm厚）组成。在纽动物中，吻部腺体上皮的顶面具有腺细胞乳头和单层簇状的成熟伪刺丝囊，这些伪刺丝囊被支持细胞的微绒毛所包围。吻部上皮顶面的一些伪刺丝囊已经释放（排出）了其核心。在吻部与猎物接触的部位，吻部腺体上皮的残留物形成了一种纤维颗粒状物质，其中嵌有已释放的伪刺丝囊。这些伪刺丝囊部分位于该物质内部，部分位于其表面，朝向猎物。粘液束与猎物的表皮紧密接触；在接触部位，位于外围的伪刺丝囊要么停留在上皮表层表面，要么嵌入其中。一些伪刺丝囊位于粘液束之外，并存在于角质层内，其释放的核心则穿透了上皮细胞。

1. 3.
   讨论

本研究首次报道了 C. cf. simula 粘液和吻部的蛋白质组学测序，并与先前获得的转录组数据进行了整合。尽管在该纽动物的转录组中鉴定出82种推定毒素转录本，但蛋白质组学分析仅确认了吻部三种、粘液三种推定毒素。然而，分泌蛋白中有相当一部分——吻部来源的22%和粘液来源的64%——在UniProtKB/Swiss-Prot数据库中未被注释。

迄今为止，唯一报道过纽动物吻部蛋白质组的研究是在针纽虫纲的 Antarctonemertes valida 上进行的。该研究鉴定出26种推定吻部特异性毒素，其中9种可被注释。这些毒素包括具有胰岛素样生长因子结合域、半乳糖结合域、antistasin样结构域和肺表面活性剂相关蛋白样结构域的蛋白质。虽然类似蛋白质也存在于其他动物毒液中，但其具体功能尚不清楚。在 C. cf. simula 的吻部，推定毒素包括类似于antistasin和白细胞弹性蛋白酶抑制剂的蛋白酶抑制剂，以及一种U-scoloptoxin(05)-Er3a样神经毒素。除了 A. valida 的吻部，antistasin/Kazal型抑制剂此前曾在异纽虫纲的 Lineus sanguineus 和 Kulikovia alborostrata 的粘液中被报道。虽然白细胞弹性蛋白酶抑制剂（SERPIN家族）未在纽动物中检测到，但其他丝氨酸蛋白酶抑制剂存在于所有纲的转录组中，其中Kunitz型抑制剂最为常见。蛇毒样丝氨酸蛋白酶也曾在针纽虫纲 Amphiporus lactifloreus 的粘液中被检测到。Scoloptoxin样蛋白质在纽动物转录组中广泛存在，并已在 A. valida 的粘液和针纽虫纲 Nemertopsis pamelaroeae 的体中被检测到。本研究中，鉴定出一种在吻部表达升高的CRP，其三维结构与神经毒素MU-AGATOXIN-I相似。这种结构相似性表明该肽可能共享agatoxin样神经毒素的机制特征，包括与离子通道的相互作用。保守的二硫键稳定支架可能确保了结构稳定性，而外围环区的变异可能调节靶标特异性。类似的通道阻断毒素曾在 L. sanguineus 的粘液和 K. alborostrata 的转录组中发现。然而，序列同源性搜索仅在与 C. cf. simula 亲缘关系较近的物种 C. hongkongiensis 中发现了推定直系同源物。

纽动物的吻部是一个长肌肉管，由身体前端的内陷形成。当吻部外翻时，腺体上皮位于外部位置，直接与猎物相互作用。 C. cf. simula 吻部的腺体上皮包括四种类型的腺细胞。III型细胞含有伪刺丝囊，而I型和II型（杆状）以及IV型（粘液样）细胞具有圆形或椭圆形的分泌颗粒。Malykin等人表明II型杆状腺细胞为TTX阳性，并且积聚在吻部腔内的粘液含有TTX。根据Montalvo等人提出的假说，粘液细胞系统及其分泌成分在吻部外翻过程中创造了一个粘性附着环境，有助于将伪刺丝囊保留在猎物皮肤上，从而增加组织损伤并促进毒素渗透。