唤醒间歇期花栗鼠肝脏 Per1 基因周期性表达恢复：哺乳动物冬眠生物钟调控新解

时间：2025年2月14日

来源：Scientific Reports

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为探究哺乳动物冬眠时外周生物钟功能，北里大学研究人员分析花栗鼠肝脏 Per1 基因表达。发现其在冬眠和非冬眠季均有周期性波动，且转录调控机制不同。该研究为理解哺乳动物冬眠生物钟调控提供新视角。

在神秘的自然界中，许多小哺乳动物为了度过寒冷且食物匮乏的冬季，进化出了冬眠这一独特的生存策略。在冬眠期间，它们的身体机能会发生巨大变化，其中生物钟的调控机制一直是科学家们关注的焦点。以往研究发现，花栗鼠作为哺乳动物冬眠者，其肝脏中 Bmal1 mRNA 在冬眠季节没有周期性波动，暗示外周生物钟在冬眠时可能不起作用；而 Per2 mRNA 水平在唤醒间歇期会因体温升高而短暂增加并出现周期性波动。但仍有诸多疑问亟待解答，比如是否还有其他基因的周期性表达在唤醒间歇期恢复？这些基因的转录调控机制在冬眠和非冬眠季节又有何不同？为了深入探究这些问题，北里大学（Laboratory of Molecular Biology, Department of Biosciences, School of Science, Kitasato University）的研究人员开展了一项关于花栗鼠肝脏 Per1 基因表达的研究。

该研究成果发表在《Scientific Reports》上，具有重要意义。它为我们理解哺乳动物冬眠过程中生物钟的调控机制提供了新的视角，有助于进一步揭示冬眠的奥秘，对于未来在医学领域开发相关治疗手段，如针对一些代谢性疾病的治疗，以及探索人体在极端环境下的生理调节机制等方面，都可能提供宝贵的理论依据。

研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在基因表达分析方面，采用了逆转录 - 定量聚合酶链反应（RT-qPCR），以此来精确测定 Per1、Creb1 等基因的 mRNA 表达水平。通过染色质免疫沉淀（ChIP）分析，研究蛋白质与 DNA 的相互作用，明确 BMAL1、CREB1a 等蛋白与 Per1 基因启动子区域的结合情况。还利用 Western blot 分析技术，检测蛋白质的表达和磷酸化水平。实验样本来源于不同状态的花栗鼠，包括非冬眠季节和冬眠季节处于不同阶段（深度蛰伏、唤醒早期、唤醒清醒不同体温阶段）的个体。

下面来看具体的研究结果：

Per1 mRNA 在冬眠季节呈现周期性波动：在非冬眠季节，将花栗鼠置于 23°C、12 h 光照 - 12 h 黑暗循环（光照在 Zeitgeber time（ZT）0 开启，ZT12 关闭）的环境中，通过 RT-qPCR 每 6 h 检测一次肝脏中 Per1 mRNA 表达，发现其在睡眠期（ZT22）达到峰值，清醒期（ZT10）处于低谷，这种昼夜节律性表达与夜行性小鼠肝脏中 Per1 mRNA 的表达一致。在冬眠季节，把花栗鼠饲养在 4°C 黑暗环境中，它们会定期经历 5 - 6 天的深度蛰伏（Tb 约 5 - 7°C）和 20 h 左右的唤醒间歇期。RT-qPCR 分析显示，唤醒早期（EA，体温未达到 30°C）的花栗鼠肝脏中 Per1 mRNA 水平相比深度蛰伏（DT，Tb 5 - 7°C）的个体显著增加，在唤醒清醒且体温为 30 - 35°C（IA - 1）的个体中呈下降趋势，在体温 35 - 37°C（IA - 2）的个体中进一步下降。这表明 Per1 mRNA 在肝脏中的水平，如同 Per2 mRNA 一样，在整个冬眠季节的蛰伏 - 唤醒周期中规律波动。
非冬眠季节 Per1 转录由 BMAL1 激活：研究人员根据小鼠 Per1 基因结构，分离出花栗鼠 Per1 基因启动子区域的基因组 DNA 片段，发现其约 1.9 kb 的 5′侧翼区域包含一个 cAMP 反应元件（CRE）和三个 E-boxes，且位置与小鼠 Per1 基因启动子区域高度保守。已知 Per1 基因转录可由时钟蛋白 BMAL1 和 CLOCK 或 NPAS2 的异二聚体通过启动子区域的 E-box 序列激活。在非冬眠季节，花栗鼠肝脏中 Bmal1 mRNA 表达有昼夜节律波动，在 ZT16 达到峰值，ZT4 处于低谷；通过 ChIP 分析发现，在非冬眠季节的 ZT22，BMAL1 与 Per1 基因启动子 E-box 的结合量增加，这与 Per1 mRNA 的波动一致，说明 BMAL1 - CLOCK 或 NPAS2 参与了非冬眠季节 Per1 基因的转录激活。而在冬眠季节，虽然 EA 时 Per1 mRNA 水平升高，但 BMAL1 与 Per1 基因启动子的结合量在 EA 和 DT 时都很低，这表明在冬眠季节 EA 时，可能有其他转录因子参与 Per1 基因的转录激活。
花栗鼠肝脏表达两种 Creb1 变体：CREB1 参与 SCN 中昼夜节律的光诱导重置，由于花栗鼠 Per1 基因 5′侧翼区域存在 CRE，研究人员为探究 CREB1 是否参与冬眠季节 EA 时 Per1 基因的转录激活，通过 PCR 分离出花栗鼠肝脏中 Creb1 mRNA 的 cDNA 克隆。结果得到两种 Creb1 cDNA，分别对应人类 CREB1 变体 6（编码 CREB1 亚型 A）和变体 3（编码 CREB1 亚型 C），命名为 Creb1a 和 Creb1c。Creb1c mRNA 比 Creb1a mRNA 多插入 590 个碱基，推测由可变剪接产生。CREB1a 含有激酶诱导结构域（KID）和 bZIP DNA 结合结构域，氨基酸序列与人类 CREB1 亚型 A 完全相同；CREB1c 只有一个 KID 域，与人类 CREB1 亚型 C 有一个氨基酸差异（M234L）。通过 Western blot 分析发现，CREB1a 存在于细胞核和细胞质中，而 CREB1c 仅定位于细胞质。将构建的花栗鼠 Per1 基因荧光素酶报告质粒转染到 HepG2 细胞中实验表明，CREB1a 可激活 Per1 基因转录，且磷酸化可增强这种激活作用；CREB1c 单独转染不改变荧光素酶活性，但加入蛋白激酶 A（PKA）后活性降低，说明 CREB1c 对 CREB1a 的转录激活有抑制作用。
Creb1 基因表达分析：通过 RT-qPCR 分析花栗鼠肝脏中 Creb1 mRNA 表达，发现无论是非冬眠季节还是冬眠季节，其总 mRNA 水平在不同时间点均无显著差异，但非冬眠季节的总水平高于冬眠季节。进一步检测 Creb1a 和 Creb1c mRNA 的比例，发现非冬眠季节从 ZT4 到 ZT22，Creb1c 与 Creb1a mRNA 的比例略有增加，冬眠季节则无显著变化。Western blot 分析显示，在非冬眠和冬眠季节，CREB1a、CREB1c 以及它们的磷酸化形式 pCREB1a、pCREB1c 水平在不同时间点均无显著差异，但冬眠季节的 CREB1a 和 pCREB1a、pCREB1c 水平均低于非冬眠季节。
CREB1a 是唤醒间歇期 Per1 基因转录的候选激活因子：利用 ChIP 分析 CREB1a 与 Per1 基因启动子区域 CRE 序列的结合情况，结果显示在非冬眠季节，CREB1a 与 Per1 基因启动子区域的结合量无显著变化；在冬眠季节，EA 时结合量开始增加（虽不显著），在 IA - 1 时达到最大。这表明 CREB1a 可能参与冬眠季节 EA 时 Per1 基因的转录激活，说明 Per1 基因在非冬眠和冬眠季节的调控存在差异。

综合研究结果和讨论部分，该研究揭示了花栗鼠肝脏中 Per1 基因在冬眠和非冬眠季节的表达规律及转录调控机制。在冬眠季节，尽管 Bmal1 基因的周期性表达缺失，但 Per1 基因与 Per2、Rev-erba 等基因一样，在唤醒间歇期呈现出与非冬眠季节类似的周期性表达，且这些基因之间的相位关系在两个季节中保持一致。这表明在唤醒间歇期，部分基因的周期性表达得以恢复，这可能对花栗鼠进入深度蛰伏以及维持外周组织的内稳态具有重要意义。同时，研究还发现非冬眠季节 Per1 基因转录主要由 BMAL1 激活，而冬眠季节 EA 时 CREB1a 可能发挥关键作用，尽管由于样本量小等因素需要进一步研究确认，但这些发现为深入理解哺乳动物冬眠过程中生物钟的调控机制提供了关键线索，有助于推动相关领域的进一步研究，对于揭示生命奥秘和探索潜在的医学应用具有不可忽视的价值。