工程化环状向导RNA增强微型CRISPR/Cas12f系统的基因激活与碱基编辑效率

时间：2025年3月29日

来源：Nature Communications

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本期推荐：为解决微型CRISPR/Cas12f系统编辑效率低下的难题，南方医科大学荣志利团队创新性设计环状向导RNA(cgRNA)，通过优化连接序列与间隔区长度，使基因激活效率提升1.9-19.2倍，腺嘌呤碱基编辑(ABE)效率提高1.2-2.5倍且编辑窗口显著收窄。该研究结合相分离系统进一步放大效应，并在小鼠肝脏验证其体内有效性，为基因治疗提供了更高效的微型工具。

基因编辑领域近年来迎来CRISPR技术的革命性突破，但传统Cas9和Cas12a系统的大分子量（约1000-1400个氨基酸）严重限制了其体内递送效率。作为解决方案，仅529个氨基酸的微型核酸酶Un1Cas12f1（简称Cas12f）因其紧凑结构备受关注，然而其编辑活性不足主流系统的1/10成为应用瓶颈。南方医科大学荣志利团队在《Nature Communications》发表的研究中，通过工程化改造环状向导RNA(cgRNA)，成功突破这一技术壁垒。

研究采用Tornado表达系统构建cgRNA，通过实时荧光定量PCR和放线菌素D处理实验证实其稳定性较线性gRNA提升194-392倍。关键技术创新包括：设计腺嘌呤-胞嘧啶富集(AC5/AC10)的柔性连接序列，优化23nt间隔区长度，并首次将相分离系统（FUS^IDR结构域）与dCas12f-VPR融合。实验系统涵盖报告基因细胞系（G3/G5）、HEK293T敲入模型及MCF7等肿瘤细胞系，结合流式细胞术、RNA-seq和深度测序(Deep-seq)进行多维度验证。

在"环状向导RNA增强CRISPR/Cas12f系统稳定性与报告基因激活"部分，研究显示cgRNA使mNeonGreen报告基因激活效率在低剂量(8ng)条件下仍保持显著，且持续时间延长至7天（线性gRNA仅维持6天）。"内源基因激活"实验证实cgRNA对HBG1等基因的激活效率最高达19.2倍，RNA-seq显示非靶向效应可控（仅18.1倍脱靶）。相分离系统的引入使激活效率再提升2.3-3.9倍，FRAP实验证实其形成具有流动性的核内液滴。

"环状gRNA优化腺嘌呤碱基编辑"章节揭示重大发现：虽然cgRNA使Cas12f丧失DNA切割活性（Sanger测序未检测indels），但dCas12f-ABE系统在AC5/10连接序列辅助下，A-to-G编辑效率提升至26.6%，且编辑窗口集中在A3/A4位点（占比81.9% vs 线性gRNA的54%）。深度测序证实该系统几乎不产生indels或其他碱基突变。"体内基因激活"实验通过尾静脉注射实现小鼠肝脏荧光素酶表达增强19.3倍。

该研究开创性地证明cgRNA可同时增强Cas12f的基因激活与碱基编辑功能，其双重优势体现在：1）物理尺寸优势（仅Cas9的1/3）更适配AAV递送；2）ABE系统的高精确性（窄编辑窗口+低脱靶）特别适用于遗传病治疗。值得注意的是，cgRNA使Cas12f丧失核酸酶活性却保留DNA结合能力的特性，为开发新型表观遗传调控工具提供了独特思路。未来结合AI预测的RNA结构优化，或将进一步释放这一微型系统的治疗潜力。