在再生医学领域，胚胎干细胞（ES 细胞）凭借其自我更新和多能性的独特能力，成为了研究的焦点。自我更新使 ES 细胞能够不断增殖并保持未分化状态，多能性则赋予它们分化为三个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）任意细胞类型的潜力。这些特性让 ES 细胞在理解早期发育、疾病建模以及潜在治疗应用等方面具有不可估量的价值。而转录因子八聚体结合转录因子 4（Oct-4），在维持 ES 细胞的自我更新和多能性方面起着核心作用。它就像一把关键的 “钥匙”，精准调控着 ES 细胞的命运，其表达水平的微小变化都可能导致细胞走向分化。
尽管 Oct-4 的重要性已被广泛认知，但目前在 ES 细胞中，还没有找到能够完全替代 Oct-4 功能的细胞基因。一些与 Oct-4 结构相似的同源物，如 Oct-1、Oct-2 和 Oct-6，无法在生成干细胞集落时代替 Oct-4。核受体亚家族 5A 组成员 2（Nr5a2）虽能在细胞重编程中暂时替代 Oct-4，但在 ES 细胞中却无法维持其功能。因此，寻找 Oct-4 的有效替代物成为了该领域亟待解决的关键问题。
为了攻克这一难题，韩国西江大学（Sogang University）的研究人员 Eun Joo Lee、Ruijing Sun 和 Jungho Kim 展开了深入研究。他们将目光聚焦在 EWS-Oct-4 融合蛋白上，旨在探究其是否能够成为 Oct-4 的有效替代物，维持 ES 细胞的多能性和自我更新能力。研究成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》杂志上。
研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞培养方面，利用四环素调控 Oct-4 表达的 ZHBTc4 ES 细胞系，通过添加强力霉素（Dox）抑制内源性 Oct-4 表达。采用蛋白质免疫印迹（Western blot）、免疫细胞化学、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）等技术检测相关蛋白和基因的表达；借助荧光素酶报告基因检测分析基因启动子活性；运用流式细胞术分析细胞周期分布；通过 MTT 检测、BrdU 掺入检测评估细胞活力和 DNA 合成情况；还进行了畸胎瘤形成实验，验证 EWS-Oct-4 在体内的功能；最后利用 RNA 测序（RNA-Seq）和分析比较不同细胞系的转录组。
研究结果如下：
- EWS-Oct-4 维持 ES 细胞自我更新潜力：研究人员利用 ZHBTc4 ES 细胞，通过细胞互补实验和蛋白质免疫印迹分析，发现 EWS-Oct-4 能在 Oct-4 缺失的情况下，维持细胞的自我更新能力和未分化状态。当添加 Dox 抑制 Oct-4 表达时，携带 EWS-Oct-4 构建体的细胞仍能保持自我更新，而表达对照载体的细胞则发生分化。
- EWS-Oct-4 促进 ES 细胞增殖：通过细胞生长实验、细胞周期分析、MTT 检测和 BrdU 掺入检测，发现 EWS-Oct-4 表达的细胞增殖速率显著高于对照载体表达的细胞。EWS-Oct-4 促进细胞进入 S 期，增强 DNA 合成和细胞活力，且其促进增殖的能力与 Oct-4 相当。
- EWS-Oct-4 调控细胞周期相关蛋白表达：RT-PCR、实时定量 PCR、蛋白质免疫印迹和荧光素酶报告基因检测结果表明，EWS-Oct-4 可下调细胞周期抑制剂 p21 的表达，抑制 p21 启动子的转录活性，从而促进 ES 细胞增殖。
- EWS-Oct-4 维持 ES 细胞多能性：APase 染色、免疫细胞化学分析和 RT-PCR 结果显示，EWS-Oct-4 能上调 APase、Nanog、Sox2 和 SSEA-1 等多能性标记物的表达，同时下调分化标记物 Cdx-2 和 Hand-1 的表达，维持 ES 细胞的多能性状态。
- EWS-Oct-4 影响细胞上皮 - 间质转化相关标记物表达：免疫细胞化学和 RT-PCR 分析表明，EWS-Oct-4 能上调上皮标记物（如 E-cadherin、EpCAM 等）的表达，下调间质标记物（如 N-cadherin、Snail 等）的表达，维持 ES 细胞的上皮表型，有助于维持其多能性和未分化状态。
- EWS-Oct-4 激活 Oct-4 下游靶基因：荧光素酶报告基因检测和 RT-PCR 分析显示，EWS-Oct-4 能激活 Oct-4 的下游靶基因 Rex-1 和 FGF-4，在转录调控方面模拟 Oct-4 的功能，强化维持多能性所需的核心转录网络。
- EWS-Oct-4 促进畸胎瘤形成：畸胎瘤形成实验表明，表达 EWS-Oct-4 的 ZHBTc4 ES 细胞在免疫缺陷小鼠体内可形成明显的畸胎瘤，且肿瘤体积和重量均显著大于对照组，证明 EWS-Oct-4 能有效替代 Oct-4 维持 ES 细胞的畸胎瘤形成特性。
- EWS-Oct-4 结构完整性对其功能至关重要：构建一系列 EWS-Oct-4 缺失突变体并进行相关实验，发现 EWS、N 端、POU 和 C 端结构域对维持 ES 细胞的增殖能力、未分化形态、细胞周期调控和 p21 表达调控至关重要，而额外的六个氨基酸对细胞增殖影响较小。
- EWS-Oct-4 与 Oct-4 转录组相似性及差异：RNA 测序分析显示，表达 EWS-Oct-4 和 Oct-4 的 ES 细胞转录组高度相似，但也存在关键差异。这表明 EWS-Oct-4 在很大程度上维持了 Oct-4 调控的转录程序，但也会引起特定基因表达的变化，这些变化的生物学意义有待进一步研究。
研究结论和讨论部分指出，EWS-Oct-4 融合蛋白可有效替代 Oct-4，维持 ES 细胞的自我更新、多能性和增殖能力。它通过多种机制发挥作用，包括促进细胞增殖、维持多能性标记物表达、调控细胞上皮 - 间质转化相关标记物、激活 Oct-4 下游靶基因等。同时，研究还发现 EWS-Oct-4 在体内可促进畸胎瘤形成，且其结构完整性对功能至关重要。此外，虽然 EWS-Oct-4 在维持 ES 细胞特性方面表现出色，但在体细胞重编程中却无法替代 Oct-4，这揭示了 Oct-4 在不同过程中的独特机制和结构功能需求。该研究为深入理解融合蛋白的功能及其在干细胞生物学和癌症中的潜在作用提供了新视角，为干细胞研究和再生医学的发展开辟了新方向，也为后续进一步探究相关分子机制和应用奠定了坚实基础。
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