褪黑素通过 BMP6/Smad1/5/9 通路促进缺血小鼠脑内血管生成：为缺血性脑卒中治疗带来新希望

缺血性脑卒中治疗手段有限，为探究褪黑素和 BMP6 在脑梗死后血管生成中的作用及机制，研究人员建立 dMCAO 小鼠模型等开展研究。结果发现褪黑素可促血管生成、改善神经功能，该成果为脑卒中康复提供理论依据。

在全球范围内，脑卒中是导致死亡和长期残疾的重要原因，其高发病率、高致残率和高死亡率给社会和家庭带来沉重负担。目前，虽然组织型纤溶酶原激活剂（tPA）溶栓和血管内取栓术在一定程度上改善了缺血性脑卒中的治疗效果，但治疗时间窗狭窄和安全性问题限制了它们的临床应用 。因此，寻找安全有效的治疗方法迫在眉睫。血管生成在脑卒中后的神经功能恢复中起着关键作用，它能够重建血管网络，恢复脑组织的血液供应，挽救半暗带区域的神经细胞 。然而，褪黑素和骨形态发生蛋白 6（BMP6）在脑梗死后血管生成中的具体作用以及它们之间潜在的调节关系尚不清楚。

为了解开这些谜团，河北医科大学第二医院的研究人员开展了相关研究。他们通过建立远端大脑中动脉闭塞（dMCAO）小鼠模型和氧糖剥夺（OGD）的人脑血管内皮细胞模型，深入探究褪黑素在缺血性脑卒中后血管生成中的作用及潜在机制。研究发现，褪黑素能够显著改善小鼠的神经功能，减少脑梗死体积。同时，它还能促进缺血半暗带区域的血管生成，增加微血管直径和血管密度，提高血液灌注。进一步研究表明，褪黑素通过激活 BMP6/Smad1/5/9 信号通路，上调血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素 - 1（Ang1）等促血管生成因子的表达，从而促进血管生成 。该研究成果发表在《Molecular Neurobiology》杂志上，为缺血性脑卒中的治疗提供了新的理论依据和潜在治疗靶点。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：

1. 动物模型构建：选用 6 - 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠，构建 dMCAO 小鼠模型模拟缺血性脑卒中；同时设置假手术组作为对照。
2. 细胞实验：使用人脑血管内皮细胞系（hCMEC/D3），进行 OGD 处理模拟缺血损伤，研究褪黑素对细胞的影响。
3. 检测技术：运用 Western blot 检测蛋白表达水平；采用定量实时聚合酶链反应（qRT - PCR）测定 mRNA 表达水平；通过激光散斑对比成像（LSCI）评估脑血流；利用双光子显微镜成像（TPMI）观察血管变化；借助免疫荧光染色分析血管生成和细胞增殖情况 。

下面详细介绍研究结果：

1. 褪黑素改善长期神经功能康复并减少梗死组织体积：通过转棒试验和改良神经功能缺损评分（mNSS）评估发现，与 dMCAO 组相比，Mel - H 组（40mg/kg 褪黑素处理）小鼠在 dMCAO 后第 7 天神经功能明显改善，且持续至第 28 天；Mel - L 组（20mg/kg 褪黑素处理）小鼠在第 14 - 28 天神经功能也显著改善。同时，Mel - H 组小鼠在第 7 天的梗死体积明显小于 dMCAO 组 。
2. 褪黑素促进缺血区域血供恢复：LSCI 检测显示，Mel - H 组小鼠在 dMCAO 后第 7 天及之后的血液灌注显著高于 dMCAO 组。TPMI 结果表明，Mel - H 组小鼠在术后第 14 - 28 天，缺血半暗带区域的微血管直径和血管密度明显增加 。
3. 褪黑素加速血管生成并促进星形胶质细胞对微血管的覆盖：免疫荧光共定位分析表明，Mel - H 组小鼠在 dMCAO 后第 7 天及以后，缺血半暗带区域的微血管密度显著高于 dMCAO 组，且 BrdU⁺/CD31⁺内皮细胞数量增加。同时，Mel - H 组小鼠在第 7 天和第 14 天的星形胶质细胞覆盖比率明显高于 dMCAO 组，且在第 14 天观察到 BrdU⁺/GFAP⁺细胞，表明星形胶质细胞再生 。
4. 褪黑素通过激活 BMP6/Smad1/5/9 信号级联促进缺血小鼠 VEGF 和 Ang1 上调：Western blot 和 qRT - PCR 结果显示，Mel - H 组小鼠在 dMCAO 后第 14 天，VEGF、Ang1、BMP6、p - Smad1/5/9 和 Smad1/5/9 的蛋白和 mRNA 表达水平均显著高于 dMCAO 组。而 BMP6 抑制剂 LDN214117 可抑制这些因子的表达 。
5. 褪黑素在体外 OGD 条件下增加内皮细胞活性：通过 PI 染色评估细胞死亡情况，发现 10μM 和 100μM 的褪黑素可显著降低 OGD 处理的 hCMEC/D3 细胞死亡率，因此选择 100μM 褪黑素进行后续体外研究 。
6. 褪黑素通过激活 BMP6/Smad1/5/9 信号级联在 OGD 后上调内皮细胞中 VEGF 和 Ang1 的表达：在 OGD 处理的内皮细胞中，褪黑素显著增强 VEGF、Ang1、BMP6 和 p - Smad1/5/9 的表达。而敲低 BMP6 表达后，褪黑素的调节作用明显受到抑制 。
7. 褪黑素通过激活 BMP6 信号促进 OGD 后内皮细胞血管生成：管形成实验和伤口愈合实验表明，褪黑素处理的细胞在 OGD 后管形成和内皮细胞迁移能力显著增强，而敲低 BMP6 可部分抑制这些作用 。

研究结论和讨论部分指出，本研究首次证实褪黑素可改善小鼠脑卒中后的神经功能，减少梗死体积，并促进血管生成和血液灌注。通过体内抑制剂实验和体外转染技术，明确了 BMP6/Smad1/5/9 信号通路参与了褪黑素对脑卒中后血管生成的正向调节作用。这一发现为缺血性脑卒中的康复治疗提供了新的理论基础，提示褪黑素可能是一种潜在的治疗药物。然而，研究也存在一些局限性，例如需要进一步探究褪黑素是否通过其他途径促进脑卒中患者的康复，以及在其他脑卒中模型中验证研究结果。未来的研究可以朝着这些方向深入开展，以进一步明确褪黑素在缺血性脑卒中治疗中的作用和机制，为临床应用提供更坚实的理论支持。