枯草芽孢杆菌表达系统对转录组的影响及谷氨酰胺酶PrgA产量提升新策略

这篇研究通过RNA测序技术系统分析了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在组成型（PamyQ）和诱导型（Pxyl）启动子驱动下表达三种工业相关蛋白（GFPnb、XynA、PrgA）时的转录组差异，揭示了启动子选择对细胞适应性及分泌压力的显著影响。研究发现组成型表达使细胞更易适应分泌压力，而诱导型表达引发更广泛的转录重编程。通过靶向调控伴侣蛋白Clp的转录抑制因子CtsR，成功将难表达蛋白PrgA的产量提升2.7倍，为工业酶生产瓶颈突破提供了新思路。

ABSTRACT

革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）因其卓越的蛋白质分泌能力被广泛应用于工业酶生产。本研究通过构建过表达绿色荧光蛋白纳米抗体（GFPnb）、木聚糖酶XynA和谷氨酰胺酶PrgA的工程菌株，比较了强组成型启动子P_amyQ和木糖诱导型启动子P_xyl对宿主转录组的影响。RNA测序数据显示，诱导型表达引发更剧烈的基因表达变化（如GFPnb诱导后121个基因差异表达），而组成型表达使细胞能逐步适应分泌压力。PrgA的表达显著激活膜锚定质量控制蛋白酶HtrA/B和硫氧还蛋白BdbB，暗示氧化折叠可能是其生产瓶颈。

INTRODUCTION

枯草芽孢杆菌作为"公认安全"（GRAS）微生物，其分泌能力可达20-25 g/L，但异源蛋白产量常低于理论值。研究采用三种特性迥异的蛋白：13.7 kDa的GFPnb（pI=6.44）、20.4 kDa的XynA（pI=9.05）和32.7 kDa的PrgA（pI=8.41），通过转录组学揭示分泌压力的通用性与特异性响应。值得注意的是，来自变形杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）的PrgA在枯草芽孢杆菌中产量极低，成为重点优化对象。

RESULTS

转录组特征分析

在组成型表达系统中，PrgA生产菌株表现出最显著的转录扰动（206个差异基因），而GFPnb仅影响3个基因。关键发现包括：

1. 1.

   分泌压力标志物HtrA/B在PrgA和XynA菌株中上调，但GFPnb不激活该通路

2. 2.

   参与嘌呤合成的pur操纵元和吡啶代谢基因pyrC被PrgA特异性诱导

3. 3.

   PBSX前噬菌体相关基因如ykzM表达显著抑制

诱导型表达则引发更广泛的代谢重编程：

• •

  所有菌株均强烈激活HtrA/B和双组分系统CssRS

• •

  碳代谢相关基因（如糖苷酶基因glcDF）表达上调

• •

  嘌呤合成基因purEKBCSQLFMND表达受抑

调控网络比较

通过GINtool分析发现：

• •

  CssR调控子在两种系统中均被激活，证实分泌压力核心通路保守

• •

  代谢调控子AraR（阿拉伯糖利用）和HutP（组氨酸代谢）与PrgA生产特异性相关

• •

  应激响应因子Spx的稳定调控子YirB在诱导条件下显著激活

PrgA产量优化

基于转录组线索进行基因改造：

1. 1.

   借鉴α-淀粉酶优化策略：过表达折叠伴侣PrsA、删除蛋白酶LonA或细胞壁修饰基因dltA均未提升产量

2. 2.

   靶向Clp伴侣系统：发现PrgA表达会抑制ClpC/E，通过删除其转录抑制因子CtsR使PrgA产量提升2.7倍

3. 3.

   氧化折叠瓶颈：PrgA的4个二硫键可能引发BdbB氧化还原酶上调，但尚未验证其改造效果

DISCUSSION

研究揭示了表达系统选择对转录响应的深远影响——诱导型启动子引发急性应激，而组成型表达允许细胞逐步适应。虽然分泌压力标志物HtrA/B的激活具有普遍性，但优化策略需蛋白特异性设计。例如：

• •

  对XynA有效的ΔlonA突变对PrgA无效

• •

  仅ΔctsR突变能显著提升PrgA产量，可能与Clp系统参与错误折叠蛋白清除有关

该研究强调工业发酵条件模拟的重要性，并证明转录组学可识别特定瓶颈（如伴侣蛋白限制），但需结合蛋白特性定制解决方案。未来可探索：

1. 1.

   持续诱导表达下的转录适应动态

2. 2.

   BdbB介导的氧化折叠优化

3. 3.

   分泌信号肽（如YoaW）对转录响应的影响

MATERIALS AND METHODS

实验采用蛋白酶缺陷型菌株BWB143（ΔaprE, ΔnprE, ΔspoIIE），通过：

1. 1.

   质粒构建：pUB110载体搭载P_amyQ/P_xyl启动子，C端添加6×His标签

2. 2.

   发酵控制：LB培养基中，诱导型系统在OD₆₀₀≈1时添加1%木糖

3. 3.

   转录组分析：固定相取样，rRNA去除后Illumina测序，DESeq2差异分析

4. 4.

   产量检测：TCA沉淀浓缩上清蛋白，Western blot定量His标签信号

该工作为枯草芽孢杆菌的工业应用提供了系统优化框架，证明靶向转录调控可突破顽固蛋白的生产瓶颈。