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本文综述了一种创新的多西环素（DOXH）负载聚己内酯（PCL）纳米纤维制备方法，通过设计实验（DoE）优化电纺参数（如电压、流速、针尖-收集器距离），并采用四组分溶剂体系（DCM/DMSO/H2O/THF）实现聚合物与药物的同步溶解。该研究为开发高效、靶向、可持续的药物递送系统提供了重要技术支撑，尤其在组织工程和感染控制领域具有广阔应用前景。
引言
纳米技术作为跨学科领域，通过分子尺度（1-100 nm）的物质操纵，在化学、生物学、医学、电子学和环境科学等多个科学与技术领域催生了创新应用。纳米材料因其独特的性能而区别于宏观尺度材料，包括增强的比表面积、更高的反应活性和量子效应，这些特性促成了其广泛的应用潜力。纳米纤维作为一维纳米材料，直径处于纳米级范围，具有高比表面积、可调孔隙率和出色的机械强度等显著特征。
在纳米纤维的多种制备方法中，电纺技术因其能够通过施加高压电场将聚合物溶液拉伸成极细的纤维而成为最有效的生产手段之一。该技术允许对纤维直径进行精确控制（通常在几十到几百纳米之间），所制备的电纺纳米纤维在生物医学领域，尤其是在药物递送、组织工程、伤口愈合和生物传感器等方面得到了广泛探索。
在药物递送系统中，电纺纳米纤维凭借其高比表面积、孔隙率以及高效包封多种药物的能力而具有多重优势。其结构能够实现活性成分的控释和持续释放，从而提高生物利用度并促进靶向递送。此外，纳米纤维可以被设计成对特定生理条件做出响应，增强其在伤口敷料和组织工程支架等临床应用中的有效性。
多项关键因素影响着电纺过程，并最终决定了电纺材料的性能。这些因素包括电场强度、针尖-收集器距离、流速、溶剂类型、聚合物浓度、粘度和溶液电导率等。这些参数不仅影响材料的应用，还决定了所得纳米纤维的直径和形态，进而影响药物释放动力学。纤维直径对加工条件尤为敏感：较高的溶液浓度和流速倾向于增大纤维直径，而更强的电场和更大的收集器距离则导致纤维更细。溶剂蒸发可能引入不规则的直径，损害纤维形态并导致结构不一致。此外，聚合物的性质（如粘度和表面张力）在纤维均匀性方面起着至关重要的作用。因此，对这些变量进行精确控制对于生产一致且均质的纳米纤维至关重要。
优化纤维直径至关重要，因为它直接影响孔隙率、机械强度和比表面积等性质，而这些性质是组织工程和药物递送等生物医学应用的关键因素。
电纺技术能够使用多种聚合物（包括天然聚合物，如胶原蛋白、壳聚糖、丝素蛋白；以及合成聚合物，如聚乙烯醇、聚环氧乙烷）来制造纳米纤维。聚合物的选择取决于机械强度、生物相容性和可加工性等因素，使其适用于组织工程、伤口愈合、药物递送和再生医学等领域。在合成聚合物中，聚己内酯（PCL）是一种广泛应用于生物医学领域的可生物降解聚酯。它具有低熔点（约60°C）、良好的机械强度和高生物相容性。PCL在体内通过水解降解，产生易于代谢的无毒副产物。这些特性使PCL成为电纺的理想候选材料，能够制造出柔韧且机械强度高的纳米纤维。因此，基于PCL的纳米纤维在生物医学研究中受到了广泛关注，特别是在组织工程支架、抗菌伤口敷料以及促进细胞生长和组织再生的应用中。
PCL纳米纤维由于其缓慢的降解速率（支持长时间内对包封药物的持续释放）而已成为药物递送系统中的有价值组成部分。此外，这些纤维可以用生物活性分子进行功能化，以增强靶向递送，提高治疗效力。这种适应性使PCL纳米纤维特别适用于局部施用各种治疗剂，包括抗生素和抗癌药物。
多种抗生素已被成功掺入PCL纳米纤维中，包括万古霉素、甲硝唑、阿莫西林和庆大霉素。此外，利用先进的双源双功率电纺装置，已合成了负载多西环素的PCL纳米纤维，用于局部药物递送和感染控制。
多西环素是一种合成四环素衍生物，是一种广谱抗生素，以其四环结构和赋予其抗菌特性的官能团而闻名。它通过结合30S核糖体亚基来抑制细菌蛋白质合成，从而阻止氨酰-tRNA的附着并抑制细菌生长。
多西环素对多种细菌感染有效，包括呼吸道和尿路感染以及皮肤感染。此外，它在治疗由细胞内病原体（如衣原体和立克次体）引起的非典型感染方面也有效。
一些研究人员发现，负载多西环素的PCL纳米纤维的释放曲线取决于多西环素的浓度：在5%载药量的情况下，最初24小时的释放量为30%–40%，并可持续7-10天。在15%载药量的情况下，他们发现了60%–70%的突释，并在约5天内完全释放，这意味着更高的载药量由于表面局部化的药物而增加了初始突释。
另一方面，在PCL/明胶（70:30）纳米纤维中含有10%多西环素的情况下，明胶的存在提高了药物释放速率，明胶增加了亲水性并加速了释放：约80%的多西环素在3天内释放（相比之下，纯PCL纤维释放约30%），并且这些纤维表现出增强的溶胀和更快的降解。
通过同轴电纺（核壳纤维），其中核为多西环素/PCL，壳为纯PCL，发现可持续释放长达3周，最初24小时释放约10%–15%。
纤维直径的影响是另一个重要参数：通过相同配方在不同电压和流速下纺丝，直径的变化导致了不同的释放速率。在平均直径为250 nm的纤维中，60%的药物量在24小时内释放，而在平均直径为700 nm的纤维中，同一时间内仅释放了30%的药物。这意味着更细的纤维增加了表面积，导致更快的释放。
实验设计提供了一种同时分析多个变量的系统方法，能够预测纳米纤维制备的最佳条件。该技术确保了客观和受控的研究，提高了准确性，并得出了关于假设的有效结论。与一次一变量（OVAT）方法（独立检查因素而不考虑相互作用）不同，实验设计（DoE）方法同时评估多个参数。DoE识别了单独和组合效应，使用编码因子水平（-1到+1）优化条件。此外，随机化的实验序列有助于最小化外部影响，改善数据解释，并提供关于变量相互作用的可靠见解。
DoE已成功应用于PCL纳米纤维的制备。例如，中心复合设计已被用于优化电纺参数，如聚合物共混比、施加电压、流速和针尖-收集器距离。同时，Box-Behnken设计已用于确定组织工程应用的生物相容性配方。基于我们最近在将多西环素掺入羟基磷灰石基电纺材料中的成功，本研究旨在开发由PCL和多西环素组成的新型纳米纤维。
然而，将多西环素与PCL共处理具有挑战性，因为两种组分具有不同的化学和溶解特性。根据现有文献，PCL最常溶解在氯仿（CHCl3）或二氯甲烷（DCM）中，这些溶剂对PCL具有优异的溶解性，并广泛用于基于电纺的纳米纤维形成。多西环素在卤代有机溶剂中的溶解度有限，但在水中具有良好的溶解度。DCM和水的不可混溶性导致相分离、不均匀分布和降低的药物生物活性。
我们提出的溶剂混合物——二氯甲烷（DCM）、二甲基亚砜（DMSO）、水和四氢呋喃（THF）——是一个四组分、均相的系统，结合了水混溶和水不混溶的组分，允许PCL和多西环素同时溶解。DCM和THF由于其低沸点而促进快速纤维形成，而DMSO和水的较慢蒸发精细控制干燥曲线并促进药物在聚合物基质中的均匀分布。这种组合提供了微调纳米纤维形态特性（如孔隙率和表面光滑度）的机会，并且还促进了药物以稳定、生物活性形式的掺入。
在当前的文献中，尚无已知具有如此组成的溶剂系统能够同时优化聚合物和药物的溶解性以及纤维形成所需的流变学和蒸发特性。相比之下，我们开发的系统提供了提高电纺过程再现性、稳定纤维形成和提高载药效率的机会。因此，所研究的四组分溶剂组合不仅代表了一项技术创新，而且可能有助于开发更高效、靶向和长期可持续的药物递送系统。
此外，我们研究了从制备的材料中活性化合物的释放曲线。为了实现精确优化，采用DoE来改进影响电纺过程的参数。
方法
所有使用的材料均为分析级，无需额外纯化程序。用于生产PCL基纳米纤维的PCL（3 mm颗粒，平均分子量为80,000 g/mol）由Sigma-Aldrich提供。氯仿（99.0%–99.4% GC）购自Honeywell，二氯甲烷（纯度≥99.5%）来自VWR Chemicals，四氢呋喃（纯度≥99.9%，无水）和二甲基亚砜（纯度≥99.7%）是Sigma-Aldrich的产品。多西环素盐酸盐（纯度≥93.5%）购自Sigma Aldrich。咖啡因EMPROVE Ph.Eur.级，购自Merck。
电纺使用FLUIDNATEK LE-50台式实验室e拉伸机进行。
使用扫描电子显微镜（SEM）与CFEG SEM Hitachi SU8230检查实验过程中产生的各种纳米纤维垫的形态。使用ImageJ软件从SEM图像确定纤维直径及其分布。每种情况下的平均纤维直径基于50-100根单独纳米纤维的测量计算。
使用安捷伦1200系列HPLC系统，配备Phenomenex Luna 5 µm C8(2) 100 Å色谱柱（100 × 4.6 mm）和Phenomenex Security Guard（4 × 2.0 mm），用于分析解吸的多西环素。使用的流动相是乙腈:水（65:35）的等度混合物。使用的流速为0.3 mL/min，柱温设定为35°C。
使用安捷伦6410三重四极杆质谱仪，配备电喷雾离子源，进行LC-MS/MS分析。运行时间为5分钟/样品。数据采集和处理使用MassHunter软件进行。质谱仪在正离子模式下运行，用于分析物和内标（IS）。氮气用作雾化气和碰撞池气。使用MRM（多反应监测）进行定量， transitions为：m/z 445.5→428.5，碰撞能量20V，用于多西环素；m/z 195.4→138.4，碰撞能量20V用于咖啡因（IS）。
使用二氯甲烷（DCM）和二甲基亚砜（DMSO）以7:3的体积比制备5.76%（w/v）的PCL溶液。将多西环素盐酸盐（DOXH）溶解在蒸馏水中，并调整所得溶液的浓度，以在电纺纤维中实现最终DOXH浓度分别为1 µg/mL（PCL/DOXH_1）、3 µg/mL（PCL/DOXH_3）和5 µg/mL（PCL/DOXH_5）。在每种情况下，将1 mL DOXH储备液加入聚合物溶液中，然后加入2 mL四氢呋喃（THF）。将混合物搅拌24小时。
所有配方的电纺过程在相同条件下进行，使用0.5 mL/h的流速、17 kV的施加电压和13 cm的针-收集器距离。
通过准确称量参考物质，在乙腈中制备咖啡因（54000 ng/mL）的储备溶液。通过准确称量DOXH，在超纯水中制备DOXH（10000 ng/mL）的储备溶液。
通过从储备溶液连续稀释到适当水平，使用超纯水作为溶剂，新鲜制备分析物和内标的工作溶液。
在聚丙烯管中，向425 µL空白溶液（乙腈:水，50:50%）中加入25 µL内标溶液和50 µL分析物，产生DOXH的最终浓度分别为10、25、50、100、150、300、600、1000 ng/mL。
PCL/DOXH_1样品：向17 µL样品中加入25 µL内标（IS），用458 µL溶剂（乙腈:水，50:50%）稀释，将所得样品转移至HPLC自动进样器小瓶并注入分析系统（10 µL/样品）。
PCL/DOXH_3样品：向5 µL样品中加入25 µL IS，用470 µL溶剂（乙腈:水，50:50%）稀释，将所得样品转移至HPLC自动进样器小瓶并注入分析系统（10 µL/样品）。
PCL/DOXH_5样品：向3.5 µL样品中加入25 µL IS，用471.5 µL溶剂（乙腈:水，50:50%）稀释，将所得样品转移至HPLC自动进样器小瓶并注入分析系统（10 µL/样品）。
使用材料PCL/DOXH_1、PCL/DOXH_3和PCL/DOXH_5进行DoxH解吸测量。通过在室温下将每个样品浸泡在60 mL蒸馏水中来研究药物的释放。在不同时间间隔t（5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 360, 420, 480分钟）取出0.0883 g PCL/DOXH_1、0.0816 g PCL/DOXH_3和0.0593 g PCL/DOXH_5样品，并立即用等体积的新鲜SBF替换。使用吸附的DoxH量和在水中释放的DoxH量计算解吸效率ηd（%）。使用LC-MS/MS测量监测解吸。
结果与讨论
本研究首次提出了一种使用单喷嘴电纺系统生产含多西环素的PCL纳米纤维的方法，通过确定促进活性成分和聚合物同时溶解的最佳溶剂混合物。通过实验设计方法，系统优化了关键参数，包括流速、施加电压、收集器与针之间的距离以及DOXH浓度。
为了获得具有所需性能的纳米纤维，进行了多次尝试。
初步实验使用甲醇-氯仿、二氯甲烷-氯仿或氯仿-甲醇溶剂混合物来获得掺入多西环素的纳米纤维。这些尝试基于我们先前关于制备掺入多西环素的聚乳酸-羟基磷灰石纳米纤维（PLA-HAP）的研究。然而，这些方法被证明无效，因为使用这些混合物无法实现活性化合物的溶解。为了确定用于电纺的最佳溶剂系统并确保聚合物和多西环素的溶解性，使用不同比例的二氯甲烷（DCM）、水、二甲基亚砜（DMSO）和四氢呋喃（THF）测试了几种配方。这些溶剂混合物的组成详见表1。
仅成功获得了样品9的均相溶液，随后将其用于进一步实验。通过将PCL溶解在二氯甲烷（7 mL）和二甲基亚砜（3 mL）的溶剂混合物中，制备了浓度为5.76 w/v%的聚合物溶液。将多西环素盐酸盐（DOXH）溶解在蒸馏水中，得到纳米纤维中的最终浓度分别为1 µg/mL（PCL/DOXH_1）、3 µg/mL（PCL/DOXH_3）和5 µg/mL（PCL/DOXH_5）。将1 mL DOXH溶液加入聚合物溶液中，同时加入2 mL四氢呋喃（THF），并在室温下摇动混合物24小时。然后将所得溶液装入注射器用于电纺。将收集器放置在13 cm的距离处，并用烘焙纸覆盖以便于纤维收集。电纺参数设置为17 kV的电压和0.5 mL/h的流速。
使用扫描电子显微镜（SEM）对合成的纳米纤维的形态和直径进行了表征。在所有三种配方（PCL/DOXH_1、PCL/DOXH_3、PCL/DOXH_5）中，SEM分析证实形成了具有轻微表面不规则性的光滑纳米纤维。未检测到显著的结构断裂，确保了纳米材料的完整性。此外，纤维表现出随机取向，这可能有助于增强柔韧性和拉伸强度。平均纤维直径因配方而异，PCL/DOXH_1为635 nm，PCL/DOXH_3为400 nm，PCL/DOXH_5达到757 nm平均直径。SEM图像和平均直径如图1所示。不同活性化合物浓度下电纺过程中纤维直径的变化可归因于几个因素，如溶液粘度、聚合物-溶剂相互作用、电荷密度或蒸发速率以及射流稳定性。增加活性化合物（DOXH）的浓度可以改变电纺溶液的粘度，影响纤维形成。较高的粘度通常导致更粗的纤维，而较低的粘度导致更细的纤维。
DOXH的存在影响聚合物在溶剂系统中的溶解性和分布。不同的溶解效应可以改变电纺过程中的射流稳定性，导致纤维直径的变化。较高浓度的活性化合物可以改变溶液的电导率，影响在施加电场下纤维的拉伸和伸长。较高的电荷密度可能由于增加的拉伸而导致更细的纤维。
受活性化合物浓度影响的溶剂组成决定了纤维形成过程中的蒸发速率。溶剂性质的变化可以影响射流细化，影响最终的纤维直径。
纤维直径在决定活性化合物的释放曲线方面起着至关重要的作用。药物释放研究的最佳直径受多种因素影响，包括药物扩散机制、聚合物组成和预期应用。更小的直径通常由于增加的表面积和减少的扩散障碍而导致更快的药物释放。研究表明，亚微米纤维（100-500 nm）在实现控制药物释放方面特别有效，因为它们提供了持续释放和结构完整性之间的平衡。为了研究加工参数和DOXH浓度对纤维直径的影响，进行了一系列实验。选择PCL/DOXH_1和PCL/DOXH_5纳米纤维作为模型材料，因为它们的直径值相似。基于先前的发现，系统调整和监测了关键电纺参数，包括聚合物浓度、流速、施加电压和针与收集器之间的距离，以评估它们对纤维形态和直径的影响。
实验设计（DoE）方法的应用在优化纤维直径方面起着至关重要的作用。DoE是一种反应优化的系统方法，能够同时改变多个因素以有效探索实验空间内的不同条件。通过采用这种技术，可以评估广泛的反应参数，同时最小化所需实验的数量。实验设计过程可以构建为三个不同的阶段：进行统计计划的实验，计算数学模型的系数，并验证模型以确保其预测准确性。这种方法提高了过程效率，并为优化纤维形态和特性提供了稳健的框架。
在本研究中，实验设计（DoE）方法的主要目标是建立一个数学模型，量化关键参数对纤维直径和形态的影响。研究的参数包括DOXH溶液的浓度（c）、施加电压（U）、针与收集器之间的距离（L）和流速（v）。这些因素的具体值详见表2，它们的编码和实际值见表3。
通过使用DoE，研究人员可以系统地优化实验条件，实现对因素相互作用及其对纤维性能影响的全面评估。这种方法论增强了对不同参数如何控制纤维形态的理解，进而影响药物释放行为。最终，这些见解有助于开发更高效和有效的药物递送系统。
因子水平的选择基于多重考虑，包括实验范围和因子固定中的潜在误差。在确定影响因素的数目及其各自效应后，建立了实验设计。为了改进和优化设计，使用了Minitab程序。为了评估所选因素对纤维直径的影响，实施了一个简化的实验设计。在这些计划的实验中，仅测试了因素的极值（最小值和最大值），不包括中心点。应用响应面方法来分析因子-响应相互作用。总共进行了12次实验，系统改变了特定参数值。实验中使用的参数的编码和实际值详见表4。
在完成实验试验和随后的数据分析后，开发了一个数学模型来描述关键参数与纤维直径之间的关系。模型系数量化了变量之间相互作用的强度，提供了它们各自影响的见解。为了系统地检查这些效应，使用中心复合设计应用了响应面方法（RSM）。
分析得出以下方程（方程1）：
d（μm）= 7.316 - 0.680 c - 0.002022 q - 0.3092 U - 0.3158 L + 0.000370 c·q + 0.00900 c·U + 0.02210 c·L + 0.000103 q·L + 0.01347 U·L
(1)
通过确定系数（R²）值为99.98%进行相关性分析来评估模型的效率，表明99.98%的观察到的变化得到有效解释，仅留下0.02%未解释。此外，调整后的（R²）值为99.74%进一步支持了模型的稳健性，确认了其在表示所研究参数之间潜在关系方面的可靠性。
通过方差分析（ANOVA）评估回归模型的拟合优度，如表5所示。
ANOVA为此目的提供了一个有效的统计框架，能够识别主效应，检测双因子相互作用，并客观评估它们的相对贡献。通过揭示因素之间的协同或拮抗关系，ANOVA允许研究人员瞄准最关键的因素并设计优化的实验条件，减少对试错方法的依赖，并节省时间和材料。
在本研究中，ANOVA用于系统评估聚合物溶液浓度（c, mg/mL）、流速（q, µL/h）、施加电压（U, kV）和针尖-收集器距离（L, cm）以及它们的双因子相互作用对所选响应变量的影响。该分析不仅旨在识别统计上显著的主效应，而且还旨在发现可能影响过程性能和纳米纤维质量的交互效应。
结果表明，整体模型具有统计显著性（p = 0.038），证明所选因素共同解释了观察到的方差的很大一部分。来自Fisher F检验的高F值和低p值证实了模型的可靠性。例如，浓度和流速的主效应产生了极高的F值（429.71; 584.37），p值远低于0.05（0.038; 0.031），表明它们对响应变量的强烈影响。相反，施加电压和针尖-收集器距离显示出较低的F值（10.88; 5.47）和较高的p值（0.187; 0.257），表明它们的独立效应不太明显。
同时，在第7-11行中，中等的F值（199.91, 808.76, 47.85, 200.37, 139.65）和较低的p值（0.054, 0.022, 0.091, 0.045, 0.054）表明统计显著性，尽管程度低于前四种情况。在最后两行（12-13）中，非常低的F值（2.27, 167.4）和较高的p值（0.373, 0.049）表明没有足够的证据确认相应系数的统计显著性。
双因子相互作用揭示了额外的、潜在的关键影响。浓度和流速之间的相互作用（cq, p = 0.022）强调了一个参数效应依赖于另一个参数的水平，而浓度-距离（cL, p = 0.045）和电压-距离（U*L, p = 0.049）相互作用表明某些组合可以共同增强纤维形成或射流稳定性。尽管一些相互作用的p值略高于传统的0.05阈值（例如，0.054或0.091），但由于自由度有限和潜在的实际意义，这些结果仍然值得注意。
为了说明主效应和相互作用的相对重要性，基于标准化t值构建了帕累托图（图2）。超过临界t值12.71的效应被认为具有统计显著性。这种可视化证实了浓度和流速在主效应中的主导地位，并强调了cq、cL和U*L相互作用的相关性。
总体而言，ANOVA为理解电纺过程提供了一个稳健的框架，能够分离和排序影响因素及其相互作用。这些见解对于生产负载多西环素的聚己内酯（PCL）纳米纤维特别有价值，其中均匀的药物分布、受控的纤维形态和过程稳定性对于有效的牙周治疗至关重要。通过将统计分析
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