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本研究发现EV71（肠道病毒71型）的非结构蛋白3A（3AV75A）及聚合酶3D（3DV63A+M393L）突变可协同提高病毒基因组复制保真度，通过深度测序和体外酶学实验证实其高保真表型及减毒机制，为抗病毒药物和减毒活疫苗研发提供新靶点。
RNA病毒因其缺乏DNA病毒所具有的校对系统，在复制过程中表现出较高的突变率，每轮基因组复制的错误率介于10−4至10−6之间。这种易错的复制机制使RNA病毒能够快速适应环境变化，进而影响病毒的进化与致病机制。然而，突变率必须被严格控制在最优水平，过高可能导致错误灾难，而过低则可能无法克服选择压力。调控复制保真度已成为合理设计减毒活疫苗的新策略，因此识别关键的保真度调控因子并探究其精确机制具有重要意义。
RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）作为病毒复制的核心元件，是调控复制保真度的关键调节因子，特别是在基因组小于20 kb且缺乏校对及其他复制后修复机制的正链RNA病毒中。已在多种病毒中鉴定出多个与RdRP相关的保真度变异体，例如脊髓灰质炎病毒（PV）的3DG64S、肠道病毒71型（EV71）的3DG64R/3DG64T/3DL123F/3DS264L、口蹄疫病毒（FMDV）的3DM296I、柯萨奇病毒B3（CV）的3DF232L、基孔肯雅病毒（CHIKV）的nsP4C483Y、甲型流感病毒的PB1V43I以及冠状病毒（CoVs）的nsP12V553I。除RdRP外，冠状病毒中的病毒校对核酸外切酶（ExoN）作为一种大RNA病毒（即大于20 kb）中独特的病毒蛋白，首次被鉴定通过切除错误掺入的核苷酸或核苷类似物抑制剂参与保真度调控。最近的研究还表明，CHIKV的非结构蛋白2（nsP2），一种病毒解旋酶/蛋白酶，可与病毒聚合酶nsP4协同调节复制保真度。这些发现不仅强调了RdRP对复制保真度的重要性，也凸显了探索其他调控保真度的病毒蛋白组分的必要性。
EV71是引起婴幼儿手足口病（HFMD）的病原体，属于小RNA病毒科肠道病毒属。其基因组为7.5 kb的正链单链RNA，编码一个大的多聚蛋白，该多聚蛋白被加工成三个主要前体：一个结构区P1（VP4–VP1）和两个非结构区P2和P3（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）。P3区包括复制复合体的关键组分，其中功能性前体蛋白3CD可进一步被切割形成3C（病毒蛋白酶）和3Dpol（病毒RdRP）。3AB是P3区编码的另一种前体蛋白，是一种小的膜结合蛋白，其3A部分包含一个核心疏水区可插入膜中，两侧为N端（3A的可溶性部分）和C端（3B肽）区域。它可进一步水解成3A和3B（也称为VPg，是RNA复制的蛋白质引物）。3A/3AB在病毒复制中具有多种功能，例如将病毒聚合酶3Dpol锚定到发生复制的膜囊泡上；稳定RNA模板、引物和3Dpol之间的复合物以刺激RNA聚合酶活性；以及作为核酸分子伴侣促进RNA的正确折叠。
先前的研究通过传代病毒种群筛选抗核苷/核苷酸类似物（NAs）的耐药变异体，从而鉴定出影响复制保真度的因子。采用相同的传代策略，我们之前筛选出了带有3A和3Dpol突变的EV71 NITD008（一种腺苷类似物，作为登革热病毒的候选药物）耐药变异体。这表明这些突变可能代表了新的保真度决定因子；特别是3A蛋白可能通过未知机制在调控病毒复制保真度中发挥重要作用。
为了测试3A和3D蛋白内突变在保真度中的作用，对感染后72小时（hpi）收获的P1野生型（WT）和变异体（3AV75A、3DV63A+M393L、3AV75A-3DV63A+M393L以及作为低保真度变异体对照的3DF232L）的病毒上清液进行RNA提取，然后进行深度测序。在此分析中，次要变异体数量的减少或均方根偏差（RMSD）的降低意味着病毒具有高保真表型。每个样本的平均深度均超过100,000倍，基因组序列覆盖度达到100%。
对次要变异体的分析表明，与WT病毒相比，3AV75A、3DV63A+M393L和3AV75A-3DV63A+M393L病毒产生的突变更少，保真度分别提高了1.24倍、1.29倍和1.39倍，而对照3DF232L病毒的保真度相比WT病毒降低了1.1倍。一致地，除3DF232L病毒具有较高的RMSD值外，3AV75A、3DV63A+M393L和3AV75A-3DV63A+M393L病毒的RMSD值显著低于WT病毒，表明3A和/或3D蛋白中的这些突变可以提高EV71的保真度。在用NITD008处理后，我们也比较了每个变异体和WT病毒的保真度。从次要变异体和RMSD值的数据均得出相同结论，保真度顺序为WT < 3AV75A < 3DV63A+M393L < 3AV75A-3DV63A+M393L，进一步证实了这三种变异体的高保真表型。总之，3A和3D蛋白在细胞培养中协同调节复制保真度。
此外，我们比较了WT、3AV75A、3DV63A+M393L和3AV75A-3DV63A+M393L变异体在Vero细胞中的多步生长曲线和一步生长曲线，未观察到每个变异体与WT病毒之间的病毒产量存在显著差异，这进一步排除了变异体保真度提高是由病毒复制受损导致的可能性。
由于复制受限或适应度较低，先前的研究表明高保真RNA变异体在动物体内会减毒。为了评估有限的种群多样性是否会在细胞培养中带来适应度代价，比较了WT病毒和高保真变异体的适应能力。正如预期，高保真变异体无法与WT病毒有效竞争，病毒适应度降低。
为了进一步评估这些高保真变异体是否减毒，我们在免疫正常的新生ICR小鼠中进行了感染实验。与WT病毒相比，三种高保真变异体的存活时间延长，后肢麻痹等临床症状减弱，呈现减毒表型。我们随后在感染后第4天（4 dpi）测定了这些变异体在各种组织（包括脑、肌肉、肝、肺、脾和小肠）中的病毒滴度。在大多数组织中，这些变异体与WT病毒之间的病毒载量没有显著差异，仅在3DV63A+M393L和3AV75A-3DV63A+M393L变异体的脑和肌肉中观察到略有降低，以及在3DV63A+M393L变异体的肝脏中分别观察到略有降低。为了研究EV71高保真变异体的体内进化，在4 dpi时从主要靶组织（脑和肌肉）中分离出病毒种群，并通过深度测序进行分析以评估种群遗传多样性。在脑和肌肉中，高保真种群的多样性相对于WT病毒有所减少，其特征是RMSD值降低，尽管在肌肉中WT病毒与3AV75A/3DV63A+M393L变异体之间没有统计学差异。随后，鉴定了小鼠中检测到的频率为0.5%或更高的单核苷酸多态性（SNPs），以表征组织特异性的多样性模式，这指的是在脑或肌肉组织中发现的SNPs组成。在大脑中，来自高保真毒株的频率高于1%的SNPs数量少于来自WT的SNPs，并且0.5%–1%的SNPs数量差异更大。在肌肉中，与WT相比，高保真变异体的0.5%–1%和>1%的SNPs数量也有所减少，并且存在一些与大脑和Vero细胞不同的非共享SNPs。在跨基因组的SNPs组成中，从脑和肌肉组织分离的WT种群的多样性模式相似，与高保真毒株的模式一致。这些结果表明，高保真变异体在小鼠脑和肌肉中产生的遗传多样性较低的种群，与细胞培养的结果一致。总之，这些结果表明EV71的高保真变异体在宿主中减毒，并表现出有限的组织特异性多样性模式和适应度。
为了进一步研究V63A和M393L突变如何影响保真度，进行了体外聚合酶实验，以评估在相对饱和的核苷三磷酸（NTP）底物浓度下，同源和非同源核苷酸掺入的动力学。使用包含33-mer模板链和10-mer引物链的T33/P10 RNA构建体进行引物依赖性聚合酶实验。对于EV71 WT 3Dpol和V63A + M393L 3Dpol，在每个时间点都显示了相似的14-mer产物RNA延伸谱，并且在相对饱和的NTP浓度（300 µM）下，通过粗积累率估计的正确核苷酸掺入的观察速率常数（kobs）没有明显差异。相比之下，F232L 3Dpol的kobs大于WT 3Dpol。这些数据表明，当使用同源NTP作为底物时，3Dpol中的V63A + M393L突变对RNA合成没有影响。
为了获得保真度变化的更定量视角，评估了WT、V63A + M393L和F232L 3Dpol的保真度值。已知用氢取代NTP核糖的2′-OH基团（例如2′-dATP和2′-dCTP）会损害NTP与病毒RdRP之间的相互作用，导致核苷酸掺入效率降低。我们首先使用2′-dATP模拟非同源核苷酸，并将保真度值计算为正确的kobs除以不正确的kobs。V63A + M393L 3Dpol在100 µΜ和300 µΜ浓度的2′-dATP下分别比WT 3Dpol保真度高1.25倍和1.1倍。在相同条件下，对照F232L 3Dpol的保真度分别降低了2.15倍和1.56倍，与之前的研究一致。此外，通过监测NITD008的NTP形式（NITD008-TP；一种链终止子）的利用来评估保真度值。通过添加GTP和NITD008-TP启动反应，可以通过12-mer产物的积累随时间监测NITD008单磷酸（NITD008-MP）的掺入。正如观察到的，V63A + M393L 3Dpol随时间推移持续掺入更少的NITD008-TP，其保真度值比WT高2.36倍，而F232L 3Dpol的保真度值相对于WT 3Dpol降低了1.05倍，证实了V63A + M393L 3Dpol的保真度提高。
此外，测试了仅GTP掺入，观察到WT和V63A + M393L 3Dpol之间11-mer产物的积累速率相似，表明第一步GTP掺入对后续NTP或错配/非同源NTP（包括多步反应中的NITD008-TP）的掺入速率影响很小。为了更准确地确定WT和V63A + M393L 3Dpol之间NITD008-TP辨别的差异，进行了单核苷酸掺入实验。由聚合酶驱动，将一个“G”掺入RNA模板/引物双链体中以形成延伸复合物（EC，带有11-mer产物），然后将其纯化并用于通过监测由U:NITD008-TP错配产生的12-mer产物的生成来确定NITD008-TP的掺入速率。正如所示，V63A + M393L EC产生12-mer产物的速率比WT EC慢。总之，这些数据表明V63A + M393L突变提高了3Dpol在RNA合成过程中错配辨别能力。
为了探索3AB蛋白对保真度的调控机制，我们首先研究了3AB对3Dpol催化的U:NITD008-TP错配的影响，使用体外聚合酶实验。已经证明3AB的3A和3B区域具有协同效应，可刺激3Dpol催化的体外RNA合成；因此，在以下实验中使用3AB蛋白。为了提高3AB蛋白的溶解度，在3AB的N端添加麦芽糖结合蛋白（MBP）标签以促进其折叠。同时，也表达和纯化了对照的仅MBP蛋白。根据反应流程图测量了WT和突变体在3AB和3Dpol蛋白之间不同组合的RNA产物。正如先前报道的，与单独的3Dpol蛋白相比，添加3AB蛋白显著刺激了14-mer RNA产物的产量，程度各不相同。为了进一步量化3AB对3Dpol RNA合成的刺激作用，分析了在正确核苷酸掺入实验中3Dpol在有和没有3AB的情况下的kobs值。WT和V75A 3AB都能刺激WT和V63A + M393L 3Dpol的聚合酶活性，并且WT和V75A 3AB之间没有观察到显著差异，表明V75A突变不影响3AB刺激3Dpol催化的RNA合成的活性。
为了进一步研究添加3AB蛋白是否会调节3Dpol的保真度，在同一反应中用NITD008-TP替代ATP底物。正如所示，当添加WT或V75A 3AB蛋白时，由WT/突变体3Dpol催化的12-mer RNA产物的产量在不同时间显著加速，尽管在WT 3Dpol的背景下，有和没有WT 3AB的kobs之间没有显著差异。通过比较每组的保真度值，表明添加WT和V75A 3AB大大提高了WT 3Dpol的保真度，但对V63A + M393L 3Dpol的保真度影响很小。此外，对照MBP蛋白对聚合酶的活性没有影响。同时，我们也遵循相同的策略，通过将EC与3AB预孵育来研究3AB蛋白对11-mer EC反应系统中NITD008-TP掺入的影响，但没有观察到明显的刺激作用，这证实了先前的报道，即3AB不刺激3D在稳定碱基配对的模板上的活性。这些结果表明WT和V75A 3AB都能够提高由WT 3Dpol催化的RNA合成的保真度。
据报道，3AB作为核酸分子伴侣具有螺旋去稳定活性。为了解决3AV75A变异体的高保真表型是否与3AB蛋白的分子伴侣活性相关，进行了体外核酸螺旋解旋实验，以研究V75A突变对3AB的RNA分子伴侣活性的影响。将不同浓度的纯化3AB蛋白添加到由六氯荧光素（HEX）标记的RNA底物组成的核酸螺旋解旋反应中以启动反应，1小时后通过天然PAGE凝胶电泳 followed by Typhoon成像仪扫描测定解旋的双链（ds）RNA的产量。与WT 3AB相比，V75A 3AB表现出较慢的螺旋解旋活性，特别是在低浓度（1 µΜ）下。随后，通过计算每个时间点解旋RNA的百分比，测量了在1 µΜ浓度下WT和V75A 3AB启动的反应中dsRNA解旋的动力学。与WT 3AB相比，V75A 3AB显示出较慢的螺旋解旋活性，暗示降低的RNA分子伴侣活性与3AB突变体的高保真调控之间存在潜在关系。
在核苷类似物存在的情况下，通常可以通过传代病毒种群以筛选耐药变异体中的特定氨基酸替换来鉴定影响复制保真度的因子。使用相同的传代策略，我们之前筛选出了带有3A和3Dpol突变的EV71 NITD008耐药变异体。这促使我们进一步研究这些突变是否参与保真度调控。正如深度测序分析所证明的，所有这些突变，包括3AV75A、3DV63A+M393L和3AV75A-3DV63A+M393L，都导致了高复制保真度，其特征为：（i）在3AV75A、3DV63A+M393L和3AV75A-3DV63A+M393L种群中，细胞培养中的突变频率分别降低了1.24倍、1.29倍和1.39倍；（ii）与WT病毒相比，脑和肌肉组织中的序列多样性和组织特异性多样性模式显著降低。与先前关于保真度改变总是导致适应效率低下和毒力减弱的报道一致，高保真度的3AV75A、3DV63A+M393L和3AV75A-3DV63A+M393L变异体在免疫正常的乳鼠中表现出适应度降低和显著减毒。这些数据提供了强有力的证据，表明EV71非结构蛋白3A和3Dpol协同调节复制保真度，突出了它们作为疫苗候选物的潜力。
关于此类突变体观察到的减毒潜在机制，据我们所知，目前有以下观点，其中大多数基于对充分表征的高保真PV 3DG64S变异体的研究，该变异体表现出毒力降低：（i）PV 3DG64S变异体在确定的选择压力下降低了病毒适应度，使其在小鼠组织中的传播减少可能是由病毒聚合酶保真度增加引起的；（ii）也有人认为，该变异体的毒力是由准种内不同变异体之间的相互作用决定的，这可能有助于在小鼠中的扩展和复制；以及（iii）复制速度对病毒毒力比遗传多样性更具决定性，正如对PV 3DG64S生长缺陷的补偿恢复了毒力，而对保真表型的补偿却没有的事实所证明的那样。在我们的研究中，与PV 3Dpol中G64S突变引起的生长缺陷不同，EV71 3A或3Dpol蛋白中的突变对细胞中的病毒增殖影响很小。因此，这表明在我们的研究中观察到的这些3A和3Dpol变异体的减毒可能至少不主要归因于它们与WT病毒之间病毒复制速度的差异。
在过去的几十年里，大量工作揭示了RdRP中复制保真度的分子决定因素。出乎意料的是，变异/突变位点广泛分布在RdRP核心中。因此，相信可能存在更复杂的机制。在这里，EV71中的V63A和M393L聚合酶突变都落在已知调节RNA合成的位点附近。在V63的C端，残基G64在涉及N端和聚合酶 motif A 的氢键网络中起关键作用；其突变G64S已被记录为小RNA病毒的已知高保真突变，并增加对利巴韦林的抗性。此外，残基M393与聚合酶 motif E 相邻，并与 motif E 残基K376和R377形成疏水相互作用，这些残基又与产物RNA的-1至-3骨架区相互作用。体外聚合酶实验数据表明，V63A + M393L突变增加了核苷酸辨别能力，当提供非同源NTP（2’-dATP/NITD008-TP）时，降低了过程性延伸和单核苷酸实验中的RNA延伸速率。最近，PV聚合酶中M393V的类似位点也被报道赋予高保真表型，进一步证实了该位点在保真度调控中的重要作用。
相比之下，目前尚无关于3A/3AB蛋白在保真度调控中的报道。我们的体外聚合酶实验数据表明，3AB蛋白，无论是WT还是V75A突变体，在WT和V63A + M393L 3Dpol蛋白的背景下，对RNA合成过程中的保真度产生不同的影响（增加 vs. 无影响），尽管两种聚合酶都表现出由3AB引起的一致刺激。许多关于3AB刺激3Dpol催化的RNA合成的研究都是在PV上进行的。认为3AB通过促进3Dpol利用3′-羟基末端作为链延伸位点来刺激RNA合成。在此过程中，可能需要3AB与这些位点相互作用并稳定它们，和/或可能将3Dpol招募到该位点。已经表明，许多与RNA或3Dpol的结合位点都在3B序列内，尽管3A和3B区域之间可能对3AB功能存在协同效应，并且3Dpol上相应的接触表面位于保守 motif E 附近的一个疏水斑块。因此，3A序列中的V75A突变对3AB的刺激活性影响很小是合理的。关于3AB（无论突变与否）如何调节WT 3Dpol催化的RNA合成保真度，目前仍不清楚。另一方面，还需要更多的工作来确定3AB无法影响V63A + M393L 3Dpol RNA合成保真度是否归因于由M393L突变引起的3AB-3Dpol相互作用的损害，该突变位于3Dpol的接触表面。
据报道，3AB可以作为具有螺旋去稳定活性的核酸分子伴侣来促进RNA的正确折叠，尽管其机制仍不清楚。随后进行了体外螺旋解旋实验，以研究V75A突变对3AB的RNA分子伴侣活性的影响。此外，由于缺乏3Dpol蛋白，该实验在某种程度上可以进一步剖析3A/3AB在保真度调控中的作用，为3AV75A变异体的高保真表型提供直接解释。结果表明，尽管V75A突变位于3A蛋白的膜结合区域，超出了已报道的分子伴侣功能区域（3A的最后7个C端氨基酸加上完整的3B蛋白），但它能够导致螺旋解旋速率降低，特别是在低浓度下。与丙氨酸相比，缬氨酸是一种较大的疏水残基，因此与膜具有更强的疏水相互作用。它经常存在于膜蛋白紧密堆积的疏水核心中。对EV71 3A/3AB拓扑结构的分析表明，3A/3AB蛋白就是这种情况，因为预测的膜结合区域中存在相当多的Val残基，暗示了Val残基的基本功能。尽管关于膜结合区域和分子伴侣功能区域之间的相互作用仍不清楚，但在许多RNA病毒中，RNA重塑蛋白，如RNA分子伴侣或解旋酶，在保真度调控中发挥重要作用似乎是一个常见事件，正如CHIKV的高保真G641D nsP2（一种病毒解旋酶-蛋白酶蛋白）也表现出延迟的解旋酶活性所证明的那样。基于EV71 3AB和CHIKV nsP2共享的这些共同特征，V75A 3AB蛋白螺旋解旋活性的降低可能有助于3AV75A/3AV75A-3DV63A+M393L变异体的保真度增强。3AB诱导的高保真表型背后减慢的螺旋解旋活性的详细机制仍有待在未来工作中探索。
总之，我们的发现确定了3A调节EV71的复制保真度。这支持了一个模型，即EV71使用多种非结构蛋白来忠实地复制RNA基因组。此外，我们的数据表明，具有RNA螺旋解旋活性的3AB蛋白和聚合酶可能具有动态相互作用以协调EV71的复制保真度。
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