综述：无标记单分子光学检测

本综述系统评述了无标记单分子光学检测技术的最新进展，涵盖干涉显微镜（iSCAT）、等离子体激元（Plasmonics）、光学谐振器（WGM, Fabry-Pérot）及纳米孔光学镊子等核心方法。文章深入分析了其在生物分子互作、构象动力学、分子追踪及复杂样本检测中的应用潜力，并指出在灵敏度提升、小分子检测及化学特异性等方面的未来挑战，为生物物理学和精准医学研究提供了重要技术视角。

检测原理

无标记光学方法作为非侵入性工具，在检测和表征单个生物分子、探索其动力学、相互作用及本征属性方面日益重要。尽管技术不断进步，实现无标记单分子检测仍面临巨大技术挑战，这主要源于生物分子产生的信号强度极低，易被背景噪声淹没。

在没有荧光标记的情况下，光与物质的相互作用主要由非共振过程主导。对于远小于衍射极限的颗粒（如生物分子），其光学响应可由诱导偶极矩描述，并通过极化率进行量化。极化率的直接表现为散射和吸收。在可见光范围内，大多数生物分子的吸收可忽略不计，仅有少数例外（如绿色荧光蛋白GFP或血红蛋白）。对于尺寸小于光波长十分之一的小型非吸收性颗粒，其光相互作用主要由弹性瑞利散射支配。

散射截面（用于衡量散射光强度）与极化率的平方成正比。在瑞利散射区域内，生物分子的极化率与其体积、以及生物分子与周围介质（例如水，n∼1.33）之间的折射率对比度（蛋白质n∼1.59）呈线性关系。这种固有的低对比度导致散射信号极其微弱。散射截面随颗粒尺寸的减小而急剧下降，与直径的六次方成正比。例如，在水环境中，平均尺寸的蛋白质（如白蛋白）在405 nm波长下的散射截面仅为约10^–11 μm²。这种极小的散射截面长期被视为传统光学检测方法的主要障碍。

为放大微弱信号，多种信号增强策略被开发出来。这些策略包括分析物散射光与参考波之间的干涉（图1A）、等离子体颗粒的天线效应（图1B）、法布里-珀罗腔（图1C）和回音壁模式谐振器中的光学共振现象，以及金属薄膜纳米孔中的高场增强效应（图1D）。每种方法均具有独特优势，能够克服弱散射信号的挑战，进而实现可靠的无标记检测乃至单生物分子的定量成像。

干涉显微镜

干涉显微镜利用波干涉原理，以高灵敏度检测单个生物分子。该方法依赖于生物分子散射光与相干参考波之间的相互作用，从而增强通常由小颗粒产生的微弱信号（图2）。

干涉测量显微镜的基础由Frits Zernike于1935年奠定，他首次引入干涉法以增强图像对比度。到1980年代末，该技术已能检测微米级介电颗粒，并显示出纳米级检测的早期迹象。2000年代初的重大突破是干涉散射显微镜（iSCAT）理论框架的发展，该框架准确描述了实验观测。在此基础上，检测能力从纳米级金属颗粒扩展到病毒，并实现了数十千道尔顿范围内的单蛋白检测的重要里程碑。iSCAT对比度与蛋白质质量呈线性关系，使其被用作质谱的光学类比。这一能力为定量单分子成像开辟了新可能性，包括精确的质量分析、分子运输的实时追踪以及动态相互作用研究。

干涉显微镜有多种实现方式，各自采用不同的照明和检测方案，但均共享相同的基本原理：探测器接收的总光强I_t是参考波光强（|E_r|²）、散射波光强（|E_s|²）以及一个依赖于两波场之间相位差（φ）的干涉项之和：I_t = |E_r|² + |E_s|² + 2|E_r||E_s|cosφ。对于亚波长颗粒，散射光强可忽略不计。虽然参考波主导信号，但它通常可被视为时不变背景并被扣除。此时，干涉项成为检测信号的主要贡献者。

在基于反射的配置中，大部分入射光穿透基底，一小部分被反射并与生物分子的背向散射光发生干涉。这种配置构成了许多单分子干涉技术的基础，其中包括iSCAT。iSCAT已成为干涉显微镜中的领先方法，在灵敏度和多功能性方面表现出色。然而，检测强度强烈依赖于相位差，而相位差会随着分子与基底距离的变化而波动，这限制了其在某些场景下的性能。对于在千道尔顿范围内轴向扩散的分子，快速的相位波动会使信号平均化，从而将检测限制在表面结合或近表面分子。在自由扩散场景中，检测通常仅限于具有高光学对比度的纳米尺寸金属颗粒。

基于透射的干涉测量法（例如相干亮场成像COBRI）可显著减小相位依赖性。该方法依赖于前向散射光与未散射透射光束之间的干涉。这种方法减少了内部界面（如细胞膜）反射的影响，因此特别适用于在高度复杂的环境（如完整细胞）中追踪物体。然而，较小的光学对比度将检测灵敏度限制在较大的生物复合物上，这些复合物通常无法达到单分子水平。

一种新技术——纳米流体散射显微镜（NSM）通过使用纳米通道作为容器来容纳自由扩散的分子，解决了传统干涉显微镜的一些局限性。在NSM中，参考波源于纳米通道壁散射的光。纳米流体环境确保了分子的轴向位移极小，并防止了全相位振荡，从而在整个成像过程中产生稳定的信号。这种配置还允许进行扩散率测量，以及检测限与iSCAT相当的分子的质量测量。

等离子体激元学

等离子体激元是材料（通常是金属）中自由载流子集体运动产生的电磁模式。基于等离子体激元的无标记传感器依赖于折射率检测。当分子附着到表面时，环境的有效折射率发生变化，从而影响等离子体激元模式的共振条件。这表现为透射或反射模式下测量到的共振峰或凹陷的移动。

最简单的例子是表面等离子体共振（SPR），该技术于1980年代出现，至今仍是测量亲和力和速率常数最成熟的技术，甚至在克雷奇曼配置中监测反射光时可用于分析物检测。所探测的光斑尺寸至少为几微米量级，对信号有贡献的生物分子数量通常至少为10⁴–10⁵个。这引发了人们对基于单个金属纳米颗粒的等离子体激元传感器的兴趣，这些颗粒支持完全局域的模式，其探测体积小得多（距金属表面的场延伸短约10倍）， potentially enabling single-molecule resolution。例如，一个50纳米的颗粒其表面可容纳约100个蛋白质。

首篇关于纳米颗粒折射率检测的论文发表于1998年，而实时检测分子结合到单个纳米颗粒的首项研究由van Duyne小组于2002年完成，他们测量了烷烃硫醇与银颗粒的结合。实时监测生物分子相互作用的首个实例由Nusz等人于2008年发表。这些研究具有重要意义，因为它们明确宣称其目标是通过利用在暗场照明下获得的弹性散射光谱中的共振峰位移来检测单分子。然而，可能部分由于当时的仪器限制，饱和分子层的信噪比始终低于可容纳在纳米颗粒上的生物分子数量（约100个）。阻碍轻松实现单分子分辨率的一个主要问题是，对于较小的颗粒，其绝对强度会迅速降低，因为纳米颗粒的瑞利散射与颗粒尺寸的六次方成正比。因此，尽管较小的颗粒在结合较少分子时可提供相同的光谱位移，但它们也会产生较少的光子。

首次单蛋白检测演示出现在2012年。Sönnichsen小组通过监测散射的全内反射检测了纤维蛋白原在金纳米棒上的直接吸附，Orrit小组则利用基于光热显微镜的扩展方法检测了单生物分子相互作用。该技术基于引入一个调制光束来加热纳米颗粒并产生局部折射率分布，分子在颗粒附近的结合会干扰该分布。最近的进展显著提高了其时间分辨率，拓宽了其在快速过程研究中的适用性。Zhang等人展示了通过分子引起的传播等离子体激元的散射进行检测。

等离子体激元传感器的一个缺点是，由于等离子体纳米颗粒（如金纳米棒）周围电磁场的不均匀性，分子可能结合到灵敏度较低的区域（远离棒的尖端），从而避免被检测到。因此，只能检测到部分结合事件。大多数纳米等离子体激元传感器系统存在的另一个问题是其传感器表面由两种或更多种材料组成（最常见的是玻璃上的金纳米颗粒）。这对化学表面修饰提出了很高的要求，需要在保持一般排斥表面以实现特异性的同时，固定用于亲和检测的受体。

光学谐振器

另一种增强极弱散射物体（如单分子）可检测性的方法依赖于光学腔内电磁场的构建。在此类器件中，回音壁模式（WGM）谐振器扮演着重要角色。在WGM谐振器中，循环光学模式被限制在非球形腔体的外围，通常采用二氧化硅微球、环形结构或气泡板的形式（图4A）。此外，法布里-珀罗谐振器最近也实现了对直接扩散通过腔体体积的单分子的检测。

声学回音壁模式最早由Lord Rayleigh描述，其在光学中的应用自2000年代初以来显著增长。决定光学场与谐振器中纳米物体相互作用强度的两个关键参数是：（1）谐振器品质因子（Q因子），其表征场增强和腔内循环次数；（2）模式体积，其决定可用于与纳米物体相互作用的受限场比例。高Q谐振器可以实现良好的精细度值（Q因子范围从10³到10⁹）和极小的模式体积，低至单个立方波长（λ³）。这使得光与物质的相互作用高度高效。虽然这种极端限制展示了达到光与物质相互作用理论极限的基本途径，但迄今为止仅在高度定义的晶体结构中得到演示，尚未在液相传感中找到应用。WGM谐振器通常具有高Q因子和约100 μm³的模式体积，其高灵敏度使其适用于传感应用。

WGM传感的检测原理依赖于入射光与腔体的尖锐共振耦合。分析物分子在倏逝场中的存在会改变局部折射率，从而导致可测量的共振波长偏移。实现单分子灵敏度一直具有挑战性，直到基于高Q因子环形谐振器和一种名为FLOWER的方法的努力出现，并且最近基于FLOWER的研究确凿地证明了单分子检测。

为了进一步增强光学场限制，WGM谐振器与等离子体激元热点相结合，例如通过在谐振器的倏逝场中引入金属纳米棒。这种方法虽然略微降低了Q因子，但实现了高度局域化的场增强，有效地将光能聚焦到与单分子相当的体积中。这显著增加了散射幅度，提高了检测能力。当前最先进的灵敏度允许检测小生物分子，如寡核苷酸和小蛋白质（图4B, C）。此外，如果分子表现出吸收，其复极化率会导致共振光谱发生可测量的变化，最近关于通过热光学传感进行单分子吸收检测的报告也表明了这一点。强度分布不均匀且尺度与单分子尺寸相当的高度受限光学场，通常被视为追踪动态蛋白质构象变化的机会，可能为生物分子动力学提供新的见解。此外，WGM传感与高通量方法兼容，因为多个谐振器可以集成到单个芯片上。然而，实现可扩展制造技术的全部潜力仍然是一个持续研究的领域。

高精细度法布里-珀罗微腔的最新发展使得能够无标记检测和分析单个溶液相分子，而无需固定。通过将单颗粒的消光幅度与其在谐振器腔中的停留时间相关联，可以补偿光学场与瞬态颗粒未知的重叠，并推断出其流体动力学半径的统计学显著信息。然而，该系统迄今为止仅在纯水中得到演示，未在缓冲液甚至更复杂的 aqueous 溶液中演示，其应用潜力仍有待探索。

纳米孔光学镊子

另一种通过光学手段检测单生物分子的途径是利用金属薄膜中纳米孔的高场增强。高场梯度也可以使此类结构充当光学镊子，从溶液中捕获物种。在这些器件中，孔洞被聚焦激光照射以实现捕获，并监测透射强度以检测捕获何时发生。通常，通过聚焦离子束铣削制备的“双纳米孔”结构用于此目的（图6C）。

首篇关于在蛋白质上使用光学镊子方法的论文发表于2012年。有趣的是，基于观察到两种不同的强度水平，该文声称陷阱中的高场导致蛋白质变性。Al Balushi等人进一步指出，在存在小结合配体的情况下，捕获事件后的信号波动看起来不同。由于配体本身太小而不能产生透射变化，这被归因于蛋白质的构象变化。Yoo等人报道了通过类似实验实现蛋白质捕获，但使用了同轴间隙结构和相对较低的入射功率。

光学镊子方法不依赖于基于亲和力的检测，并且捕获物种的鉴定很困难。然而，它是分析单分子行为其他方法的一个有趣补充。与传统的等离子体激元传感器和平面表面的iSCAT不同，这里的分子据称处于溶液相，这提供了构象自由度。然而，表面相互作用的作用仍有些不清楚。在捕获颗粒时观察到了来自表面活性剂的效应。一些研究尝试通过PEG涂层钝化金属。尽管硫醇化PEG确实常用于此目的，但这些论文并未显示任何补充数据来证明蛋白质吸附被阻止。在一些方案中使用了PEG，而有时则未使用或未讨论该问题。然而，可以预期蛋白质会吸附到金属上。除了基于PEG的钝化策略外，支撑脂质双层作为一种替代方法被探索，用于改善纳米孔和纳米孔基生物传感器的生物相容性和功能特异性，提供了一个最小化非特异性吸附并促进膜相关受体或通道掺入的生物相关界面。

应用

无标记光学生物传感器历史上在两个主要应用领域发挥着关键作用。首先，这些传感器是研究生物分子特性及其相互作用的基础研究的重要工具。其次，它们被广泛用于检测复杂样品中的化学和生物物种，支持医学诊断、环境监测、食品安全和安全方面的实际应用。随着单分子灵敏度的实现，这两个应用领域的潜在进步得到了探索。

对于基础研究，单分子分辨率通过提供对生物分子异质性的直接访问，彻底改变了该领域。这一进步使研究人员能够检测批量测量中隐藏的稀有物种、瞬态相互作用和动态构象变化。单分子方法已经在质量和尺寸分析（图5A，“质量和尺寸分析”部分）、生物分子相互作用和动力学研究（图5B, C，“生物分子相互作用和动力学”部分）以及追踪分子运动（图5D，“分子运动追踪”部分）中找到了重要应用，将其定位为分子生物学、生物物理学和制药行业的独特工具。对于实际应用中的生物检测（图5E，“复杂样品中生物和化学物种的检测”部分），单分子灵敏度提供数字读数而非连续信号，这使其与传统批量方法区分开来。然而，这种数字特性的实际优势尚未完全阐明。以下章节将详细讨论这些应用的细节。

质量和尺寸分析

准确了解异质样品中生物分子特性的精确分布在不同领域都至关重要。例如，评估异质性（如聚集状态的检测）在蛋白质生产质量控制中至关重要。确保纯度和单分散性对于使用X射线晶体学和冷冻电子显微镜等技术进行蛋白质功能和调控的体外研究至关重要。表征复杂的高阶结构，如异质细胞外囊泡，在细胞间通讯中扮演重要角色，并作为疾病诊断的潜在生物标志物。

质量光度法是该领域的一项开创性方法，它使用干涉显微镜通过光学信号与质量的线性关系来测量单个分子的质量。SPR显微镜后来被用于基于类似原理检测分子质量。需要注意的是，测量精度不仅受系统噪声影响，还受表面粗糙度影响，后者引入灵敏度变化。在干涉显微镜中，不规则性导致相位不确定性，而在等离子体激元方法中，场限制的额外变化通常会放大测量误差。

两种方法都依赖于检测分子在表面的吸附事件。然而，吸附是一个选择性过程，由不同类型的力（如静电）驱动，并受分子特性（如电荷）影响，这在评估混合样品中不同分子群体的浓度时可能引入偏差。为了减轻这一限制，开发了诸如NSM和法布里-珀罗谐振器等技术来分析自由运动的分子。对自由扩散分子的连续观察还扩展了可测量特性的范围，包括扩散率和流体动力学半径。扩散率和流体动力学半径的结合允许区分具有相同质量但不同构象的亚群体。

生物分子相互作用和动力学

生命依赖于分子动力学的持续循环，其中（解）折叠、（解）组装和分子间相互作用的过程驱动着生命系统的复杂性。许多这些过程只能在单分子水平上观察到，因为分析许多分子平均行为的传统方法无法捕捉其复杂的动力学。

例如，基本的1:1相互作用——一个分子以简单的一对一比例结合另一个分子，不涉及中间状态或多个结合位点的情况——足够简单，可以用批量方法表征，因为基于整体的平均值为解析一个或几个相互作用参数提供了所需信息。当考虑涉及多个相互作用亚基或复杂化学计量的巨分子复合物时，情况则不同。相比之下，质量光度法使得研究复杂过程成为可能，例如免疫反应的2:1化学计量、与神经退行性疾病相关的蛋白质聚集，或蛋白质寡聚化与DNA结合之间的相互作用。通过监测关联和解离物种的时间演化，可以获得关于分子间相互作用的全面信息，包括亲和力、热力学和动力学（前向和后向速率常数，k_on和k_off）。这通过监测（解）组装过程来实现，该过程由浓度下降（解组装）或相互作用物种的混合（组装）诱导。

此外，单个分子的（解）组装和构象变化通常是不同步的，并在整体平均方法中被平均掉。评估每个分子经历的动态变化需要在其上进行足够长时间的追踪。一种方法是将分子锚定在表面上。这一原理被iSCAT用于捕获微管蛋白原丝从解组装微管末端剥离的动力学——这一过程与细胞分裂、运动性和细胞内运输调控等相关。类似地，采用纳米等离子体激元颗粒与WGM耦合的检测原理已被用于监测聚合酶酶的构象动力学，揭示其作为活性周期一部分的打开和关闭运动。

绝大多数生物和化学过程发生在溶液中，使得表面固定化成为生物分子相互作用研究中的潜在偏差来源。在一项使用基于等离子体激元散射成像的研究中，分析了抗体与相应抗原之间在天然条件下的1:1化学计量免疫反应，其中每个结合伴侣都锚定在表面上。这突出了表面基方法的潜在局限性，这些方法依赖于固定化结合伴侣。

这一局限性可以通过使用光学镊子来克服，光学镊子可以将单个分子捕获在亚波长孔洞的近场中，而无需表面附着。这一原理已被用于监测响应温度变化的折叠和未折叠蛋白质状态之间的动态转变，或研究在不同pH值下单个蛋白质的解组装。另一项研究证明了这种方法用于检查蛋白质结合相互作用；然而，由于检测到的事件数量少，无法确定动力学。这凸显了使用该方法实现高通量分析的一般挑战。为了可靠地测量动力学，需要大型数据集和强大的统计。

分子运动追踪

生物分子，生命的构建模块，处于持续运动中。温度和能量决定了它们的步伐，分子扩散、旋转，有时在定向行走中向前迈进。它们的动能证明了生命物质的动态性质。

iSCAT的进步使得能够以高时空分辨率实时观察这些分子动力学。肌球蛋白V沿着肌动蛋白丝行走的步进运动已被观察到，为了解其在纳米尺度上的运动提供了直接见解。肌球蛋白V是一种进行性运动蛋白，在细胞内运输中起着至关重要的作用，沿着肌动蛋白丝携带货物，如囊泡、细胞器和蛋白质复合物。

此外，iSCAT已被用于监测支撑脂质双层上整合膜蛋白和膜相关蛋白的扩散。这些蛋白质对于细胞功能（如信号传导和囊泡运输）至关重要，使其成为重要的治疗靶点。它们的功能通常依赖于同源和异源寡聚化，其化学计量和周转只能通过单个物种的质量动力学的时空信息来揭示。

需要注意的是，迄今为止，此类细胞内过程的追踪主要针对表面结合系统进行了演示。这一局限性强调了成像技术需要进一步进步，以捕获生物分子与其原生环境相互作用或在环境内自由扩散的动力学。

复杂样品中生物和化学物种的检测

识别和量化复杂样品中特定目标分子的浓度长期以来一直是光学生物传感的核心目标，其驱动力在于医学诊断、环境监测和食品安全方面的关键应用。特异性通常通过基于亲和力的检测来实现，其中生物识别元件（如抗体或适体）被固定在传感器的检测区域，选择性结合目标分析物。实现单分子检测被认为是亲和生物传感的终极目标，其可行性已通过多种检测原理得到展示。

单分子传感器通过直接计数单个结合事件提供数字信号，这预计使它们对通常影响整体传感器模拟信号的缓慢漂移（如温度波动）不那么敏感。这些技术还能够表征单个检测事件（如信号幅度、结合态寿命），从而允许区分不同的生物分子群体，例如那些由特异性与非特异性相互作用引起的群体。然而，它们相对于整体方法的优势仍不确定，因为尚未证明在典型生物传感场景下性能特征的明显改善。一个关键挑战在于低浓度下的检测限：目标递送和与固定化受体结合的概率随着目标浓度和可用结合位点数量的减少而降低。这个问题在具有很少固定化受体的高度限制传感体积中尤其关键。例如，在飞摩尔浓度下，一个分子可能需要数天时间才能遇到一个具有约10个受体的传感表面（对于等离子体激元纳米颗粒来说很典型）。此外，即使对于高结合速率（k_on = 10⁶ M⁻¹ s⁻¹），首次结合的平均时间，即1/(k_on × 浓度 × 受体数量)，约为1000天。为了在与传统方法相当