双靶向融合蛋白rONC-T7-pHLIP的构建表达及其增强抗肿瘤活性的机制研究

为解决传统抗癌蛋白靶向性差、效率低的问题，研究人员开展了新型双靶向融合蛋白rONC-T7-pHLIP的研究。该蛋白通过连接Onconase（ONC）、T7肽（靶向转铁蛋白受体TfR）和pHLIP肽（靶向酸性肿瘤微环境），显著增强了对肝癌HepG2和肺癌A549细胞的细胞毒性和凋亡诱导作用，且对正常肝细胞HL-7702无毒性，为癌症靶向治疗提供了新策略。

癌症是全球第二大死因，2020年全球新发癌症死亡病例高达1000万例。传统化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会损伤正常细胞，且易产生耐药性。分子靶向治疗基于肿瘤特异性标志物，有望开发出更有效、更安全的抗癌疗法。Onconase（ONC）是一种从北美豹蛙卵母细胞和早期胚胎中分离得到的碱性蛋白酶，属于核糖核酸酶超家族，其RNA降解活性远低于RNase A（核糖核酸酶A）等其他超家族成员，但细胞毒性显著更高。这可能是由于其能够逃避高等动物中的核糖核酸酶抑制剂（RIs），从而避免被灭活。ONC可直接从内体进入细胞质，进而避免RI介导的抑制。其主要机制是通过降解tRNA（转运RNA）抑制细胞蛋白表达，从而发挥细胞毒性作用。研究表明，ONC还能主动降解miRNA（微RNA）前体，贡献其生物活性。由于其细胞毒性，ONC是唯一进入III期临床试验的核糖核酸酶，并已针对多种癌症类型进行了测试。除抗癌特性外，ONC还具有抗病毒活性，通过降解病毒RNA抑制HIV-1病毒颗粒在复制细胞中的产生。

然而，ONC的临床应用受到其缓慢的细胞内在化限制，细胞对其摄取仅略快于液相。快速的肾脏积聚导致剂量限制性肾毒性，限制了其临床应用。为提高疗效，研究已将ONC与肿瘤靶向抗体融合。例如，与鼠抗CD22 IgG2a单克隆抗体LL2融合，证明ONC作为抗CD22免疫偶联物的有效载荷，兼具高抗肿瘤效力和低系统毒性。类似地，将ONC与转铁蛋白（Tf）的N端结构域融合，在大肠杆菌中创建rONC-TFn，显著提高了其肿瘤靶向能力。

转铁蛋白（Tf）和转铁蛋白受体（TfR）结合运输Fe³⁺是哺乳动物细胞中的经典运输过程之一。作为高效的靶向配体，Tf可通过偶联策略介导抗癌药物、功能蛋白和基因治疗药物的特异性递送。基于Tf-TfR特异性识别机制，可实现针对过度表达TfR的增殖性恶性肿瘤细胞的精确靶向。该过程依赖受体介导的内吞作用，实现治疗剂的高效细胞内递送。抗癌药物与转铁蛋白偶联显著增强治疗选择性和细胞毒性，同时克服耐药性，改善治疗效果。然而，Tf分子量大，不易通过融合制备。近年来，研究人员从病毒包膜蛋白中鉴定出一种小TfR结合肽（HAIYPRH），命名为T7肽。T7肽与TfR的结合位点不同于Tf，因此不影响Tf与TfR的结合。一些研究人员将T7肽与抗肿瘤药物融合表达，以提高对肿瘤细胞的靶向效果。

肿瘤酸性是实体肿瘤微环境的典型特征，进而可驱动体内肿瘤扩散，肿瘤酸性也与肿瘤生长和转移密切相关。低pH敏感肽（pHLIPs）能感知细胞膜附近的酸性条件，在酸性pH环境中由于自质子化和疏水性变化折叠成稳定的α-螺旋结构，嵌入并跨细胞膜进入细胞。目前，有大量关于pHLIP介导的药物递送系统的研究，包括荧光染料、环肽、极性毒素和蛋白药物。通过pHLIP的介导，已成功实现目标分子对肿瘤细胞的靶向定位和跨膜效应。pHLIP在肿瘤成像、肿瘤药物递送等方面发挥了关键作用。

为增强其抗肿瘤靶向效果，本研究将ONC与特异性识别转铁蛋白受体的T7肽和主动靶向低pH环境肿瘤的pHLIP肽融合。所得双靶向融合蛋白rONC-T7-pHLIP使用大肠杆菌表达。该融合蛋白可特异性结合肿瘤细胞表面实现主动靶向。使用HepG2和A549细胞研究了rONC-T7-pHLIP的体外抗肿瘤活性。结果表明，融合蛋白rONC-T7-pHLIP相比单靶向rONC（天然ONC经过密码子优化，同时保持与野生型蛋白相同的氨基酸序列）表现出更优的抗肿瘤活性，突显其作为靶向癌症治疗剂的潜力。此外，成功建立了从rONC-T7-pHLIP工程菌构建到产物分离纯化的全面工艺路线。

为开展研究，作者主要应用了以下关键技术方法：使用大肠杆菌BL21(DE3)表达系统进行重组蛋白表达；通过正交实验设计优化诱导条件（IPTG浓度、诱导时间和温度）；采用镍柱亲和色谱纯化融合蛋白；使用TEV蛋白酶切除Trx标签；通过MTT法检测细胞毒性；流式细胞术分析细胞凋亡；免疫荧光分析检测蛋白定位；核糖核酸酶活性测定评估酶活。细胞实验采用人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549和人正常肝细胞HL-7702。

Construction of expression plasmids

研究人员通过连接ONC的C端与T7肽的N端，以及T7肽的C端与pHLIP的N端，段间通过(Gly₄Ser)₃柔性连接肽连接，构建了rONC-T7-pHLIP。经过大肠杆菌偏好密码子优化和GC含量调整，由GenScript合成了540 bp的rONC-T7-pHLIP融合基因片段，然后使用Kpn I和Hind III限制位点将其连接到pET-32a(+)表达质粒中，重组表达质粒命名为pET-32a-ONC-T7-pHLIP。此外，本实验还构建了另外两个表达质粒：pET-32a-ONC-T7和pET-32a-ONC-pHLIP。通过Mlu I和HindIII双酶切和测序方法验证了三个表达质粒的大小和序列。使用I-TASSER在线服务器通过线程方法预测了这三个融合基因片段的三维结构域。

Expression and purification

使用重组质粒pET-32a-ONC-T7-pHLIP、pET-32a-ONC-T7和pET-32a-ONC-pHLIP转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达。菌株在含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培养，直至OD₆₀₀达到0.6。随后，加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mM，并在37℃、200 rpm摇荡培养4小时。使用SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定目标蛋白的表达水平。接下来，通过离心（8000 g，4℃，15分钟）收集细菌，将沉淀重悬于PBS中，冰上超声破碎，离心（12000 g，4℃，20分钟）。通过SDS-PAGE检测可溶和不溶蛋白组分（包含体）的等价性。变性的蛋白在复性缓冲液（20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 2 M尿素, 0.5 mM EDTA, pH 8.0）中用2 M尿素复性，然后在变性缓冲液（20 mM Tris-HCl, 10 mM DTT, 300 mM NaCl, 8 M尿素, pH 8.0）中变性溶解2小时。变性的蛋白用复性缓冲液（20 mM Tris-HCl, 2 M尿素, 300 mM NaCl, 1 mM GSH/0.4 mM GSSG, pH 8.0）稀释和复性，复性的蛋白使用镍柱分离纯化。用10柱体积的裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl, 2 M尿素, 300 mM NaCl, 20 mM咪唑, pH 8.0）平衡镍柱后，将复性的蛋白上样到镍柱上；用5柱体积的洗涤缓冲液洗涤蛋白，用20柱体积的洗脱缓冲液洗脱目标蛋白。收集洗脱的蛋白，并在PBS中用15 mL、10 kD超滤管（Merck Millipore, Germany）置换。所有收集的样品通过12% SDS-PAGE分析。

Optimization of expression conditions for engineered strains

为研究rONC-T7-pHLIP的最佳表达条件，需确定宿主菌的生长曲线。本实验中，以诱导时间为x轴，OD₆₀₀吸光度值为y轴，绘制了工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)/rONC-T7-pHLIP的生长曲线。工程菌株的OD₆₀₀值在培养2-3小时后达到0.6，表明进入对数生长期。培养24小时后，OD₆₀₀值开始逐渐下降，表明菌株进入衰亡期。作为乳糖类似物，IPTG可通过lac操纵子系统调节目标蛋白合成。与乳糖不同，IPTG不被细菌代谢，提供持续诱导。而且，在一定范围内，增加IPTG浓度可提高目标蛋白的表达水平。但过高的IPTG浓度可能抑制表达的进一步增加。因此，优化IPTG浓度对于获得最佳表达结果至关重要。重组工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)/rONC-T7-pHLIP在不同时间和温度下诱导，然后超声破碎和SDS-PAGE分析。使用ImageJ软件进行灰度分析，显示最佳诱导时间和温度分别为8小时和33℃。使用SDS-PAGE检测不同条件下融合蛋白rONC-T7-pHLIP的表达，并采用ImageJ软件计算目标蛋白占总菌体蛋白的百分比，表明诱导时间对表达水平影响最显著。结果表明，在0.8 mmol/L IPTG、30℃和8小时诱导条件下，rONC-T7-pHLIP的表达量占总菌体蛋白表达的47%。这与37℃、0.8 mmol/L IPTG和4小时诱导条件下的表达水平相比提高了约10%。因此，后续实验使用这些优化条件进行培养。

Separation and purification of fusion proteins

由于在融合蛋白的N端设计了His标签，变性和复性后，使用镍柱亲和色谱纯化融合蛋白rONC-T7-pHLIP、rONC-T7和rONC-pHLIP。用高浓度咪唑洗脱融合蛋白后，通过PBS超滤去除咪唑，并将蛋白与TEV蛋白酶孵育以去除融合蛋白中的Trx标签。使用镍柱进一步纯化目标蛋白。SDS-PAGE显示rONC-T7-pHLIP、rONC-T7和rONC-pHLIP的纯度高于95%。融合蛋白rONC-T7-pHLIP、rONC-T7和rONC-pHLIP的三维结构表示如图S2所示。

RNase activity assay

如图5所示，所有融合构建体（rONC、rONC-T7、rONC-pHLIP和rONC-T7-pHLIP）在5 mg/mL（10 μL）下对酵母tRNA（10 mg/mL，10 μL）表现出相当的核糖核酸降解效率，琼脂糖凝胶电泳显示条带强度模式相似。这一发现表明，T7肽和pHLIP肽均未显著影响ONC固有的核糖核酸酶活性。

In vitro cytotoxicity of fusion proteins

MTT法显示，融合蛋白对人工肝癌细胞HepG2和肺癌细胞A549表现出剂量依赖性的细胞毒性作用。rONC、rONC-T7、rONC-pHLIP和rONC-T7-pHLIP对HepG2细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）值分别约为3.83 μM、0.59 μM、0.64 μM和0.21 μM。rONC、rONC-T7、rONC-pHLIP和rONC-T7-pHLIP对A549细胞的IC₅₀值分别约为3.69 μM、0.58 μM、0.52 μM和0.34 μM。使用正常肝细胞HL-7702分析融合蛋白rONC-T7、rONC-pHLIP和rONC-T7-pHLIP对正常细胞的影响，作为阴性对照：值得注意的是，融合蛋白在浓度范围内对正常肝细胞未引起细胞毒性。这些结果表明，ONC与T7肽和pHLIP肽融合显著增强了其抗肿瘤活性，并且融合蛋白rONC-T7-pHLIP对肿瘤细胞的抑制效果远强于rONC、rONC-T7和rONC-pHLIP。

The apoptotic effect of fusion proteins on tumor cells

使用流式细胞术检测融合蛋白对细胞凋亡的诱导作用。用1 μM rONC、rONC-T7、rONC-pHLIP和rONC-T7-pHLIP处理的HepG2细胞的凋亡率分别为10.82%、18.07%、22.48%和31.21%，而相同浓度对HL-7702细胞几乎无影响。因此，rONC-T7-pHLIP强烈诱导癌细胞凋亡，对正常细胞损伤极小，且双靶向rONC-T7-pHLIP对肿瘤细胞的凋亡作用显著强于单靶向rONC-T7、rONC-pHLIP和单体ONC。

Cellular localization

通过免疫荧光分析评估了rONC-T7-pHLIP对肿瘤细胞的靶向能力。结果表明，孵育48小时后，rONC-T7-pHLIP成功结合到A549细胞，并主要定位于细胞质。这表明rONC-T7-pHLIP在靶向肿瘤细胞后，主要在细胞质区室发挥其抗凋亡作用。

本研究成功建立了从rONC-T7-pHLIP工程菌构建到产物分离纯化的全面工艺路线。该工程蛋白表现出增强的肿瘤靶向效率，从而提高了肿瘤细胞杀伤效力，最终产生了一种新型广谱抗肿瘤剂，具有精确靶向、强细胞毒性和与病变无关的活性。这种方法有潜力解决当前肿瘤治疗中的临床挑战，包括转移和耐药性。尽管靶向蛋白治疗已显示出有希望的治疗效果，但其血清稳定性和半衰期仍存在某些挑战。后续工作将侧重于使用3 L和10 L发酵罐进行高密度培养，然后建立 pilot规模的发酵和纯化工艺。

总之，本研究成功构建、表达并优化了重组双靶向融合蛋白rONC-T7-pHLIP的诱导条件。该蛋白对肿瘤细胞表现出显著强于单靶向变体（rONC-T7、rONC-pHLIP）和非靶向rONC的细胞毒性和促凋亡作用，而在有效浓度下对正常细胞无毒性。细胞定位证实了其在肿瘤细胞中的细胞质活性。总的来说，rONC-T7-pHLIP成为一种新型且有前景的靶向抗肿瘤治疗剂。