引言
理解野生动物生存模式是种群生态学和保护生物学的基础。然而，对于蝙蝠等许多物种而言，由于其夜行性、栖息地隐蔽、寿命长且繁殖率低等生物学和后勤限制，获得可靠的生存率估计具有挑战性。传统方法如标记-重捕法（Capture–Mark–Recapture）虽然能提供有价值的估计，但常受限于低重捕率、标记丢失以及需要长期数据。
作为替代方案，直接观察死亡事件可以提供关键信息，尤其是在繁殖和冬眠等生物敏感期。虽然死亡记录本身不能提供正式的生存率估计，但在识别急性威胁及其种群后果方面尤其有价值。2006年白鼻病（White-nose Disease, WND）的出现证明了死亡监测的重要性，这种真菌病原体在北美冬眠蝙蝠中引发了前所未有的死亡事件。此后，监测工作日益侧重于检测冬眠期间的死亡事件，此时蝙蝠处于生理脆弱状态，可能不成比例地受到疾病和环境压力的影响。
全面评估此类事件不仅需要记录死亡数量，还需调查其根本原因和种群影响。特别是，了解哪些年龄组受影响最大对于解释种群层面的后果至关重要。年龄特异性死亡率会影响补充率、恢复潜力和长期生存能力。齿质生长层分析（incremental dentine layer analysis）已成为一种可靠的年龄估计方法，能够清晰区分第一年个体和成年个体，特别适用于评估幼体是否面临更高的冬季死亡率。
本研究通过汇编保加利亚冬眠调查的记录，填补了冬季蝙蝠死亡率知识的空白。我们记录了异常死亡事件（UMEs），总结了其频率和地理分布。同时，我们描述了物种特异性的冬眠偏好以提供生态背景；然而，由于死亡地点数量有限，无法评估栖息地特征是否与死亡风险相关。此外，我们分析了来自保加利亚最大冬眠群落的斯氏长翼蝠（Miniopterus schreibersii）死亡个体的年龄结构，使用齿质生长层计数评估死亡率是否不成比例地影响年轻个体。我们探讨了三个相关问题：保加利亚冬眠地点报告UME的频率如何？物种在其冬眠地点的环境特征上有何差异？主要冬季群落中死亡个体的年龄组如何分布？这些内容共同为蝙蝠冬季死亡率的种群背景提供了新见解，并强调了需要更系统的监测来指导保护工作。
材料与方法
冬眠地点调查与冬眠地点特征
我们分析了来自“保加利亚蝙蝠出现记录”数据集中的冬季栖息地监测记录，该数据集通过全球生物多样性信息机构（GBIF）公开获取。本研究使用的冬季监测记录子集在补充表S1中提供。该数据集汇编了保加利亚国家生物多样性监测系统（2003–2023年）的观测记录，由环境与水资源部协调，并包括可追溯至1991年的早期调查工作。监测每年在12月1日至3月31日期间进行，最常见于2月，此时群落规模达到峰值。
每次调查中，观察者记录物种组成、群落规模、环境参数（温度、湿度）、干扰证据以及尸体计数。每个洞穴的水分状况根据保加利亚洞穴数据库中使用的国家分类进行分类，区分三种水分存在类别：干燥（Dry）、潮湿（Humid）和湿润（Wet）。对于本研究中包含的每个洞穴，相应的类别从保加利亚洞穴数据库中检索。利用这些生态变量表征了物种特异性的冬眠地点偏好。尸体在野外根据外部形态进行鉴定。虽然记录了异常死亡事件（UMEs；>7只个体），但其系统记录在不同年份和地点之间不一致。
在野外难以视觉区分且经常形成混合集群的物种被处理为物种组。鼠耳蝠（Myotis myotis）和布莱斯鼠耳蝠（M. blythii）被合并为鼠耳蝠/布莱斯鼠耳蝠（Myotis myotis/blythii），而宽耳菊头蝠（Rhinolophus euryale）、梅氏菊头蝠（R. mehelyi）和布拉斯菊头蝠（R. blasii）被合并为中菊头蝠（Rhinolophus media）。所有分析仅限于以下六个分类单元中至少一个存在的栖息地：斯氏长翼蝠（Miniopterus schreibersii）、卡帕辛鼠耳蝠（Myotis capaccinii）、鼠耳蝠/布莱斯鼠耳蝠（Myotis myotis/blythii）、铁蹄菊头蝠（Rhinolophus ferrumequinum）、小菊头蝠（R. hipposideros）和中菊头蝠（Rhinolophus media），并且需要具备群落规模和环境协变量数据。
在30年的监测期内，访问了超过109个冬眠地点。调查频率因地点而异：优先洞穴，如Devetashka、Parnicite和Ivanova Voda，几乎每年都被访问，有些年份不止一次。相比之下，较小或不易到达的地点调查较不规律，通常间隔两到三年。
蝙蝠采样
我们的种群结构分析侧重于斯氏长翼蝠（Miniopterus schreibersii），一种食虫且穴居的蝙蝠。该物种高度依赖地下栖息地，全年主要占据洞穴和废弃的矿坑。成年个体重10–18克，但该物种以其体型而言异常长寿，已知野外个体寿命可达22年。保加利亚的长期标记-重捕研究证实其寿命超过12年。在保加利亚，斯氏长翼蝠在其分布区内形成了一些最大的冬季群落。几个栖息地易于接近，便于观察和收集死亡个体。本研究的所有样本均在2022年冬眠期结束时从Parnicite（Dolen Parnik）洞穴收集，该洞穴在一个混合物种群落中估计有53,468只目标物种个体。该隧道状系统延伸2.5公里，有持续水流和两个入口。群落占据出口附近的一个区域，那里水流较慢形成小水池。在2022年2月和3月冬眠期结束时，从水面上收集了40具尸体，并在-20°C下保存。由于保存状况不佳或牙齿缺失，六具尸体被排除在分析之外，最终样本量为34具。从每个个体上，使用金属镊子在10倍放大倍率的卡尔蔡司STEMI 2000立体显微镜下拔取上犬齿。材料保存在保加利亚索非亚国家自然历史博物馆的收藏中。尸体收集依据保加利亚《生物多样性法案》颁发的许可进行。
实验室处理与年龄测定
成年个体的年龄通过上犬齿的横截面确定。齿质中的生长层表现出复杂的结构，主要元素表现为一条宽度不一的深染线，代表一整年的生命。共分析了34个斯氏长翼蝠死亡个体的样本。
样本（上犬齿）在中性缓冲福尔马林中固定并保存数月，用含有Triton™ X-100（0.3%）的磷酸盐缓冲液洗涤两次，在0.15 M EDTA中脱钙10–14天，冲洗，通过梯度乙醇脱水，在二甲苯中透明，包埋在Paraplast Plus®中，切片厚度为15 μm，并用苏木精和伊红（H&E）染色。样本在明场条件下使用Amplival显微镜观察和拍照，并连接EOS 2000D相机。使用Helicon Focus软件堆叠多张图像以改善对焦。
年龄估计通过计数横截面中的齿质生长环进行。由于蝙蝠的齿质环计数只能提供近似 chronological ages，个体根据观察到的环数被分为更广泛的生物学年龄组：幼年（1个环）、亚成年（2–3个环）、成年（4–5个环）和老年成年（≥7个环）。环计数由三名研究人员独立进行，最终类别分配基于共识。每只蝙蝠被归类为幼年、亚成年、成年或老年成年，代表生理成熟度和预期冬眠准备程度的增加水平。
数据处理与统计分析
数据管理和统计分析在R（版本4.1.3）中进行。使用janitor包清理和协调数据，并使用ggplot2生成可视化图表。
异常死亡事件（UME）
为避免重复洞穴访问造成的伪重复，我们在物种×栖息地水平上总结了数据集。对于每个栖息地，我们提取了：（1）栖息地海拔，直接从数据集中作为固定地点属性获取；（2）每个物种和冬眠地点所有冬季访问记录的平均个体数；以及（3）平均栖息地温度，基于每个冬眠地点所有可用温度测量值。此过程在六个物种或物种组中产生了146个栖息地条目。
物种特异性冬眠偏好
使用Kruskal–Wallis检验测试物种间在栖息地温度和海拔上的差异。为了评估平均群落规模是否与这些变量相关，我们使用glmmTMB拟合了一个负二项广义线性模型，以平均群落规模为响应变量，物种身份、栖息地温度和栖息地海拔为固定效应。使用DHARMa基于模拟的诊断评估模型拟合和分布假设。由于温度和海拔均未显示出对群落规模的可检测影响，我们还为每个物种拟合了简单的线性模型，以量化每个环境梯度解释的群落规模变异比例（R2）。
年龄结构分析
总结并分析了年龄组频率，以评估斯氏长翼蝠的死亡率是否均匀分布在各个类别中，使用卡方拟合优度检验。为每个年龄组的个体比例计算了精确的95%二项式置信区间，并计算了依赖比（年轻个体（幼年+亚成年）与成年个体（成年+老年成年）的数量之比），以量化年龄特异性死亡率偏差。
结果
冬季死亡率记录
在保加利亚的九个冬眠地点记录了七种蝙蝠的冬季死亡率。大多数异常死亡事件（UMEs）集中在2012年冬季，随后年份在较少地点记录了额外事件。死亡率在分类和地理上分布不均：斯氏长翼蝠（Miniopterus schreibersii）造成了最大且最反复的损失，特别是在Devetashka和Parnicite洞穴，而卡帕辛鼠耳蝠（Myotis capaccinii）和鼠耳蝠/布莱斯鼠耳蝠（Myotis myotis/blythii）在同一冬季在Ivanova Voda经历了大量死亡。相比之下，宽耳菊头蝠（Rhinolophus euryale）和铁蹄菊头蝠（R. ferrumequinum）仅零星受影响，在不同地点和年份有少量分散记录。尸体计数因物种和地点而异，斯氏长翼蝠在Devetashka和Parnicite的数量最大，这两个地点调查更频繁，因此检测到更多死亡个体。
物种特异性冬眠偏好
在整个保加利亚，物种表现出对冬眠地点的明显偏好。大多数蝙蝠选择低海拔的潮湿洞穴，而其他物种则占据较冷的高海拔栖息地。这些模式表明，潮湿和稳定的微气候通常更受冬眠青睐。统计分析支持这些观察结果。栖息地温度在物种间存在显著差异（χ2= 23.3， df = 5， p < 0.001），栖息地海拔也是如此（χ2= 18.6， df = 5， p = 0.002）。斯氏长翼蝠使用的条件范围最广，从温暖的洼地洞穴到寒冷的高地地点。卡帕辛鼠耳蝠和鼠耳蝠/布莱斯鼠耳蝠与较冷、较高海拔的栖息地相关，而小菊头蝠和中菊头蝠组主要发现在温暖的洼地洞穴中。铁蹄菊头蝠倾向于使用中间条件。所有物种主要与潮湿和湿润的洞穴相关，表明对潮湿冬季栖息地的共同偏好，同时在温度和海拔利用上表现出对比模式。尽管物种在选择栖息地方面存在差异，但海拔和温度均不能解释群落规模的变异。负二项模型显示两个变量均无显著效应（均 p > 0.58），并且物种特异性线性模型对丰度变异的解释很少。因此，群落规模主要在物种间存在差异，而不是取决于此处测量的环境条件。
年龄结构分析
在收集的40具尸体（约占群落的0.07%）中，34具适合年龄分析，并被分配到四个年龄组：亚成年（47.1%）、幼年（26.5%）、成年（20.6%）和老年成年（5.9%）。死亡率在各年龄组间分布不均（χ2= 11.882， df = 3， p = 0.0078）。亚成年和幼年个体占死亡的大部分，而成年和老年成年个体相对较少。精确二项式95%置信区间证实了这些差异，依赖比（2.78）表明年轻个体的死亡率几乎是成年个体的三倍。总体而言，数据揭示了冬眠地点内越冬死亡率的明显年龄偏差。
讨论
死亡事件的发生与监测局限性
本研究分析了保加利亚蝙蝠冬眠地点的冬季死亡记录。由于可用数据在不同地点和年份的调查覆盖范围不同，我们的推论必然是描述性的。异常死亡事件（>7只个体）仅在定期调查的重要地下栖息地中的四个地点有记录。虽然不常见，但此类事件可能影响当地种群，不应被视为异常而忽视。其明显的稀缺性可能反映了真实低发生率以及由于监测协议不一致和洞穴内食腐动物或洪水迅速清除尸体而导致的严重漏报。
冬季死亡对长寿、K-选择物种的种群影响
冬季死亡对长寿、K-选择物种可能产生不成比例的种群后果，这些物种的种群增长受成年生存率强烈制约，且年繁殖产出低。因此，即使死亡率短期增加也会产生持久的种群偏差，特别是在小型或孤立的群落中。这些特征使冬季死亡率成为蝙蝠种群长期存续的潜在重要瓶颈。
保加利亚蝙蝠研究与死亡记录的历史背景
保加利亚早期的蝙蝠研究主要侧重于群落评估和地下栖息地的保护，系统记录死亡事件仅在后期出现。然而，历史证据支持这样一种观点，即在定期监测开始之前，冬季死亡事件未被充分记录。来自Ivanova Voda和Parnicite洞穴的非系统野外观察描述了1994–1995年和1999–2000年冬季观察到的死亡蝙蝠。在Devetashka洞穴，至少有一次UME（十具尸体）在河流中被记录到，并且在2003年之前在群落下方或周围发现了骨骼遗骸。在2003年之后的一次对Ivanova Voda的访问中，在洞穴湖中看到了额外的漂浮尸体。虽然这些记录缺乏系统量化，但它们表明零星死亡事件可能比记录的时间更早发生，这表明此类事件可能长期以来一直是影响蝙蝠群落的自然或环境压力机制的一部分。这些早期零散的观察反映了一个从其他欧洲蝙蝠监测计划中已知的更广泛模式，即冬季计数传统上侧重于群落规模而非死亡率，并且标准化UME记录很少被纳入常规调查。因此，保加利亚的案例并非例外；相反，它例证了机会性、非标准化监测在整个欧洲历史上限制了冬季死亡的检测和解释这一更广泛的挑战。
调查努力量的偏差对结果解释的影响
自定期冬季蝙蝠监测开始以来，调查努力量一直不均匀，一些冬眠地点每年或每季多次访问，而其他地点仅偶尔调查。这种访问频率的差异影响了检测尸体的概率，并导致地点间数据完整性的显著差异。因此，此处报告的死亡率统计主要反映了调查最频繁的栖息地，而不是全面的全国情况，因此必须描述性地解释不同地点和年份之间的比较。死亡事件与群落规模之间的明显关联应在此背景下看待：尽管较大的群落似乎受影响更大，但先前的UME模型表明群落规模本身并不是可靠的风险预测因子。在我们的数据集中，这种模式可能反映了上述调查努力量偏差，因为最大和最重要的栖息地每年都受到监测，因此提供了更多检测尸体的机会。增加冬季调查的一致性并将标准化尸体记录纳入常规监测将提高检测死亡事件和评估其驱动因素的能力。
冬季死亡的潜在驱动因素：环境极端事件与生理背景
冬季死亡可能由多种因素引起，包括突然的环境极端事件。在我们的数据集中，死亡率升高发生在异常寒冷的2012年冬季，但没有连续的微气候数据，无法验证这种联系，其他解释仍然合理。由于微气候或区域气候指数未被纳入我们的分析，我们无法验证2012年的寒冷条件是否促成了该年冬季观察到的死亡率升高。欧洲其他地方报告了类似的寒冷驱动的死亡率峰值：在2010/2011年冬季，贝希施泰因鼠耳蝠（Myotis bechsteinii）的死亡率增加了十二倍，并且在荷兰、比利时和波兰记录到纳特尔鼠耳蝠（Myotis nattereri）的严重下降，表明大陆范围的天气异常可能导致急性越冬损失。生理背景进一步支持这种解释。在欧洲一些地区，斯氏长翼蝠现在由于气候变化条件而以减少的脂肪储备冬眠，增加了它们对寒冷时期的敏感性。同时，新出现的证据表明，某些物种，包括斯氏长翼蝠，从事冬季觅食作为补偿能量亏缺的策略。因此，延长的寒潮可能通过增加能量需求同时限制蝙蝠补充耗尽储备的能力而产生双重约束。尽管模型工作表明，在稳定条件下，延长冬眠可以增强寿命，但连接寒冷异常、冬眠行为和死亡率的经验证据仍然很少。这些考虑表明极端冬季条件可能促成死亡事件，但这无法用现有数据确认。连续的微气候监测，结合系统检索和记录尸体，对于识别冬季死亡的环境机制和改进未来UME的早期检测至关重要。
人为压力与气候事件的交互作用
严冬可能进一步与慢性人为压力源（如栖息地破碎化、土地利用变化和基础设施扩张）相互作用，降低群落从偶发性损失中恢复的能力。气候相关极端事件和人类压力的综合效应已被日益认为是快速变化景观中蝙蝠种群生存力的关键决定因素。这种相互作用可能有助于解释为什么即使是中等程度的死亡也会对小型或孤立种群产生持久影响。
尸体保存与检测偏差
尸体保存强烈影响野外死亡记录的方式。在Devetashka洞穴，尸体被端足类动物（如Gammarus pulex cognominus和Niphargus bureschi）迅速分解或被鼩鼱食腐，而在Ivanova Voda，它们经常漂浮持续较长时间。相比之下，在一些地点（如Parnicite），肿胀的尸体可能持续漂浮到春季，但在其他地点下沉更快。河流和湖泊之间的这些差异强调了栖息地类型和死后过程如何可能使检测产生偏差，使跨地点比较复杂化。食腐动物活动不仅模糊了死亡率估计，还可能构成病原体传播的一个被忽视的途径，突出了将食腐动物动态纳入未来死亡率评估的重要性。特别是，进入蝙蝠洞穴的哺乳动物可能有助于这些环境内的尸体清除和病原体循环。然而，关于它们在保加利亚的存在和行为系统数据仍然缺乏。
监测协议与方法的挑战与展望
一个主要挑战是缺乏记录冬季死亡率的系统协议。历史上，此类事件通常被视为大型群落中“正常”损失的一部分，因此未被记录。在许多监测计划中，尸体收集的程度没有明确报告，限制了定量推断的可靠性。死亡事件的零星发生进一步降低了检测的可能性。解决这些差距需要协调、标准化的方法，包括定期调查关键冬眠地点、系统回收尸体以及使用既定的尸检协议来区分环境相关和疾病相关的死亡原因。新技术，如牙齿磨损分析，可能提供关于年龄结构的额外见解，尽管其效用仍受限于稀疏的比较数据集。
冬眠偏好对死亡风险的影响
物种特异性在冬眠地点利用上的差异也可能影响对冬季死亡率的脆弱性和尸体检测的可能性。然而，死亡事件数量有限，阻止了对这些栖息地特征如何与死亡风险相关联进行正式评估。在我们的数据集中，大多数蝙蝠与低海拔的湿润、潮湿洞穴相关，而其他物种占据较冷的高海拔栖息地。这种偏好可能反映了冬眠期间能量需求和微气候稳定性之间的权衡。处于更可变和不利环境中的群落可能面临来自严冬的更大风险（例如Ivanova Voda），而那些处于更稳定栖息地的群落可能受益于减少的能量成本。然而，死亡仍然发生在这样的地点，如在Parnicite观察到的那样，尽管检测可能因调查更频繁而产生偏差。因此，评估栖息地特征不仅应作为潜在的避难所，还应考虑它们如何影响死亡事件的可见性。
年龄估计方法的不确定性及替代技术
使用齿质和牙骨质生长线估计蝙蝠年龄存在相当大的不确定性。线条清晰度因物种而异，计数可能在牙齿或切片间不同，并且外部因素如机械应力可能产生非年度增量。在老年个体中，环可能合并或变得模糊，限制了高级阶段年龄估计的准确性。在某些分类群中，一年内可能形成多个层，而在其他情况下，计数可能低估已知年龄。表观遗传学的最新进展提供了一个有希望的替代方案。蝙蝠甲基化时钟的发展现在允许直接检验与年龄相关生存的假设。表观遗传分析提供了准确的年龄估计，并与性别和社会群体间的死亡率风险变异相关联。此外，甲基化时钟为评估基于牙齿的年龄估计方法提供了一个独立的基准，后者在很大程度上未经验证且存在显著不确定性。因此，虽然所使用的方法提供了有用的见解，但它不能产生精确的 chronological ages。然而，使用年龄组中和了这一缺点，使该技术适用于本研究。
死亡年龄结构模式的种群学解释
考虑到这些方法学上的不确定性，Parnicite的年龄结构表明死亡率跨越几个年龄组，年轻个体占主导地位。由于40具尸体仅占群落的约0.07%，它们并不反映其整体种群结构。因此，对此模式的解释是谨慎的，因为群落的真实年龄分布仍然未知，并且缺乏关于当地野外长寿的可靠数据。年轻蝙蝠的主导地位可能仅仅反映了它们在群落中的数量优势，或者，它可能表明存活过早期年份的个体表现出相对较高的持久性。对 pipistrelle 蝙蝠（Pipistrellus pipistrellus）的标记-重捕研究支持后一种观点，显示幼体生存率在冬眠前后均比成年低约20–25%。同样，贝希施泰因鼠耳蝠（Myotis bechsteinii）表现出可忽略的衰老，生存和繁殖甚至到高龄都保持稳定；该物种的死亡率似乎主要由偶发的严冬驱动，而不是内在衰老。总的来说，这些发现表明早期生命死亡率可能是长寿蝙蝠中的一个关键 demographic filter。
遗传反应与 demographic 监测的重要性
此外，重复冬季死亡的种群效应可能先于任何可检测的遗传信号，因为对种群下降的遗传响应通常在一代或多代后才出现。这种时间滞后是年补充率低的长寿物种的特征，其中种群波动可能在延长时间内保持遗传不可见。这种区别强调了即使在遗传数据显得稳定时， demographic 监测的重要性。
结论
本研究首次对保加利亚冬眠地点的冬季蝙蝠死亡率进行了结构化评估，表明UMEs罕见但可能因监测不一致和尸体快速消失而未被充分检测。地点间尸体持久性的差异突出了强烈的检测偏差，而斯氏长翼蝠（Miniopterus schreibersii）死亡个体中年轻个体占主导地位支持了早期生命是长寿蝙蝠关键 demographic filter 的作用。主要限制仍然是缺乏标准化的冬季监测
