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本研究通过蛋白质组学及免疫学方法，首次系统鉴定血蛤中的IgE结合蛋白，发现35个相关蛋白并筛选出9个新候选过敏原（如HSP90、铁蛋白、血红蛋白），揭示其与虾类的高度交叉反应性，为评估血蛤过敏风险提供新依据。

Katarina Smiljanić | Maja Mladenović Stokanić | Teodora Cvetić | Maša Babović | Ole N. Jensen | Aleksa Savić | Dragana Mitić | Vesna Jovanović | Danijela Apostolović | Marianne van Hage | Tanja Cirkovic Velickovic

贝尔格莱德大学 – 化学学院，分子食品科学卓越中心及生物化学系，塞尔维亚贝尔格莱德

摘要

血蛤（Anadara broughtonii 和 Tegillarca granosa）在东南亚地区被广泛食用，但可能引发过敏反应。虽然原肌球蛋白和精氨酸激酶已被确认为过敏原，但其更广泛的过敏原谱以及与虾的交叉反应性仍不甚明确。我们采用基于凝胶和LC-MS的蛋白质组学技术，结合三种算法和IgE免疫测定方法，研究了对虾敏感患者的IgE反应性。在鉴定出的2580种蛋白质中，有35种来自血蛤，其中9种被预测为过敏原。从IgE反应性的2D凝胶斑点中，我们确认了已知的过敏原原肌球蛋白和精氨酸激酶，并预测了17种新的候选过敏原，包括HSP90、铁蛋白和血红蛋白-Hb1。此外，从IgE反应性斑点中还鉴定出MHC和α-肌动蛋白，这些是丰富的肌原纤维支架蛋白，且没有在IUIS中注册的同源物。总体而言，35%的血清对血蛤蛋白质产生了反应，且与蓝贻贝的ELISA结果存在强烈相关性。这些发现扩展了血蛤的过敏原库，并为食品过敏原风险评估提供了新的候选物质。

引言

鱼类和贝类是蛋白质的重要来源，2021年全球消费量超过1.6亿吨，人均消费量超过20公斤（FAO，2024年）。贝类是甲壳类和软体动物的统称，属于不同的分类学类别。软体动物是动物界中第二大门类，包含约150种可食用物种，在UniProt数据库中注册了超过124万个蛋白质序列。其中最具商业价值的类别是双壳类，包括牡蛎、贻贝、扇贝和蛤蜊。甲壳亚门在数据库中注册了约80万个蛋白质，按消费量和养殖量计算，主要的可食用甲壳类动物是虾和明虾（Boenish等人，2022年）。

贝类过敏是北美成年人中最常见的食物过敏类型（59%的食物过敏患者的首次过敏反应是由贝类引起的），总体患病率为2-3%（Kline等人，2025年）。它是食物过敏导致急诊就诊的主要原因，包括在亚洲和澳大利亚（Heidari等人，2025年）。全球约40-50%的甲壳类过敏患者会对软体动物产生反应，而具有软体动物过敏史的患者对甲壳类的过敏风险更高（>70%）（Al等人，2021年）。贝类之间的广泛交叉反应性主要源于无脊椎动物的原肌球蛋白是一种泛过敏原，在许多无脊椎动物物种中具有显著的序列同源性，包括甲壳类、软体动物、寄生虫和昆虫（Leung等人，1996年；Yan等人，2025年）。软体动物的原肌球蛋白与甲壳类的原肌球蛋白有约60%的序列相似性，在同一分类群内高度相似，但在不同软体动物群体间则不相似（Emoto等人，2009年）。2022年发表的一项意大利多中心研究调查了对虾过敏的患者对软体动物的反应情况，研究作者认为当前的诊断方法不足以预测甲壳类和软体动物之间的交叉反应性（Scala等人，2022年）。对于贝类过敏的检测仍应依赖新鲜样本的皮肤测试，尤其是在儿童人群中（Zivanovic等人，2017年）；而对于对虾过敏的患者，当临床病史、现有诊断方法和耐受性测试支持时，应从饮食中排除贝类（Scala等人，2022年）。

世界卫生组织/IUIS过敏原列表（www.allergen.org）包括52种已注册的甲壳类过敏原和10种软体动物过敏原。在双壳类（蛤蜊、牡蛎、贻贝、扇贝）中，只有三种蛋白质组被注册为过敏原：TPM、AK和SCBP。

Anadara broughtonii（AB）和Tegillarca granosa（TG），也称为血蛤，在东南亚地区是重要的商业物种，其液态结缔组织中含有血红蛋白（Zailatul等人，2015年）。原肌球蛋白（35-37 kDa蛋白质）是TG蛤中唯一被广泛认可的过敏原（Emoto等人，2009年；Zailatul等人，2015年），此外在TG蛤中还发现了精氨酸激酶作为过敏原（Zailatul等人，2015年）。在UniProtKB数据库中，AB和TG物种分别只有111和212个蛋白质序列，其中只有4个条目在蛋白质水平上有证据支持（www.uniprot.org）。关于软体动物双壳类蛋白质序列的信息缺乏，尤其是在消费者中越来越受欢迎的情况下，以及它们潜在的过敏原特性（与对虾和其他甲壳类过敏患者血清的IgE交叉反应性），可能不仅对敏感的东亚人群有害，也对之前未接触过这些贝类的对虾过敏人群有害。

本研究首次全面分析了原始血蛤组织中的IgE反应性蛋白质，结合了基于LC-MS/MS的蛋白质组学、IgE免疫测定以及使用三种免疫信息学工具（AlgPred 2.0（Sharma等人，2021年）、AllerCatPro 2.0（Nguyen等人，2022年）和SEP-AlgPro（Basith等人，2024年）的计算机过敏原性预测方法。我们假设血蛤（Anadara broughtonii 和 Tegillarca granosa）含有除了已知的原肌球蛋白和精氨酸激酶之外的其他IgE反应性蛋白质（新的软体动物IgE结合蛋白），这些蛋白质可能导致对虾的交叉反应。同时，我们认为血蛤具有某些特异性，因为它们拥有与虾不同的独特蛋白质（如血红蛋白），这意味着并非所有的交叉反应都涉及血蛤。

化学试剂

用于凝胶电泳的化学试剂包括Tris（羟甲基氨基甲烷）、甘氨酸、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙烷磺酸（CHAPS）、尿素、硫脲、0.5% NP-40、人血清白蛋白（HSA）、二硫苏糖醇（DTT）、二甲基甲酰胺、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、三氯乙酸、Coomassie Brilliant Blue R-250（CBB）和碘乙酰胺（IAA），以及HPLC级别的胰蛋白酶和乙腈。此外还购买了两性离子和固定化的pH值试剂。

血蛤的蛋白质组学特征

贝类过敏是一种慢性疾病，通常会持续终生。尽管其发病率很高，但关于其过敏原蛋白质的知识仍然有限，尤其是在血蛤中的过敏原蛋白质方面。因此，我们的第一步是使用霰弹枪蛋白质组学方法对AB和TG血蛤进行全面的蛋白质组学分析，并结合S-trap柱和5% SDS溶液进行蛋白质分离。这种方法能够确保获得最多的肽和蛋白质信息。

结论

溶液蛋白质组学分析在血蛤（Anadara broughtonii 和 Tegillarca granosa）中鉴定出超过2500种蛋白质，其中血红蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白、精氨酸激酶和副肌球蛋白是最丰富的。综合免疫信息学工作流程在35个直接蛋白质 hit 中发现了9种过敏原候选物，包括已知的双壳类过敏原（原肌球蛋白、精氨酸激酶）和新的过敏原（HSP70/90、锰超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、铁蛋白、血红蛋白Hb1）。

CRediT作者贡献声明

Katarina Smiljanić：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、可视化、数据分析、概念化。 Maja Mladenović Stokanić：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、方法学研究、数据分析。 Teodora Cvetić：撰写 – 初稿、方法学研究、数据分析。 Maša Babović：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、数据管理。 Ole N. Jensen：撰写 – 审稿与编辑、监督。

未引用的参考文献

De San等人，2022年

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢塞尔维亚共和国教育、科学和技术发展部（[-->451-03-136/2025-03/200168 和 [-->451-03-136/2025-03/200288）、塞尔维亚科学与艺术学院GA No. F-26的财政支持；以及瑞典哮喘和过敏研究基金会（斯德哥尔摩地区ALF项目）、瑞典心肺基金会、瑞典癌症和过敏基金会、古斯塔夫五世国王80岁生日基金会、Hesselman基金会的支持。