引言
坏死性小肠结肠炎（NEC）是早产儿中一种严重的威胁生命的肠道疾病。在极低出生体重早产儿中，NEC的发病率约为7%，约十分之一的新生儿死亡可归因于NEC。在存活的儿童中，25%-61%和15%-35%的儿童分别残留有神经发育障碍和肠道功能障碍。尽管对NEC的研究不断深入，但其发病机制仍未完全阐明。
表观遗传学通过核苷酸或相关蛋白的可逆修饰，在不改变DNA序列的情况下，桥接环境因素与可遗传的基因表达改变。N6-甲基腺苷（m6A）是哺乳动物中最普遍的RNA修饰，其特征是腺苷第六位氮原子的甲基化。这种修饰受到“书写器”（如METTL3、METTL14、WTAP、METTL16）和“擦除器”（如FTO、ALKBH5）的动态调控。m6A修饰的RNA碱基被“阅读器”（如YTHDF1-2、YTHDC1-2、IGF2BP1-3、HuR、EIF3）识别，进而调控mRNA的翻译、降解和稳定性。m6A在细胞生长、免疫、组织修复以及癌症、感染、免疫紊乱、心血管和神经系统疾病等过程中具有重要影响。
m6A调节因子（书写器、擦除器、阅读器）的失调影响肠道屏障功能、微生物群和免疫稳态。在炎症性肠病（IBD）中，与对照组相比，溃疡性结肠炎和克罗恩病组织中整体m6A水平升高，且METTL3、FTO、METTL14和HuR的表达发生改变。值得注意的是，METTL3和FTO在活动性IBD中上调，而在缓解期下调。从机制上讲，METTL3通过m6A修饰促进Toll样受体4（TLR4）mRNA的翻译和稳定性，从而在脂多糖（LPS）诱导的内毒素血症中通过CXCR2介导的骨髓释放增强TLR4蛋白表达和中性粒细胞活化。METTL14缺陷会诱导结肠干细胞凋亡，破坏粘膜屏障完整性，并通过 destabilizing 核因子κB抑制蛋白（NFKBIA）mRNA和失调NF-κB通路加剧结肠炎。METTL3敲低会降低紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin、Claudin-3）的表达，损害肠道屏障功能。相反，IGF2BP1和HuR可稳定编码Occludin、JAM-1、Claudin-1、Claudin-3和E-钙粘蛋白的mRNA，从而增强翻译并维持机械屏障完整性。这些发现共同表明，m6A修饰在肠道炎症、屏障完整性维持和细胞死亡中起着关键的调节作用。作为一种多因素感染性肠道疾病，m6A在NEC发病机制中的确切作用仍有待充分阐明。
材料与方法
本研究采用序贯策略探索m6A在NEC中的作用。首先在新生小鼠NEC模型中研究RNA m6A修饰。使用“配方奶+缺氧+低温+脂多糖（LPS）”方法在4日龄小鼠中建立NEC模型。对照组小鼠由母亲哺乳。通过组织学评估（H&E染色）进行NEC损伤评估，损伤评分>2的小鼠被归类为患有NEC。使用点印迹（Dot blot）和免疫组织化学（IHC）检测整体m6A水平。通过qRT-PCR和蛋白质印迹（Western blot）检测m6A调节因子（METTL3、METTL14、WTAP、FTO）的mRNA和蛋白表达水平。
随后，收集来自NEC婴儿和对照组（先天性肠狭窄、闭锁或回肠造口术）的回肠组织样本。进行转录组测序（RNA-seq）和甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）。RNA-seq用于识别差异表达基因（DEGs），MeRIP-seq用于检测m6A修饰峰。对数据集进行整合分析，识别差异m6A修饰的DEGs，并进行基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。使用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，并通过cytoHubba插件识别核心基因。
结果
小鼠NEC模型评估
NEC组小鼠表现出较差的一般状态，包括自发性活动减少、对刺激反应减弱、毛发粗糙无光泽、皮肤干燥粗糙弹性降低、松散/泡沫样粪便、偶发黑便以及体重增加受损。模型组死亡率为21.05%，对照组无死亡。对照组小鼠肠道组织呈淡黄色且有弹性，而模型组小鼠胃肠道僵硬、无弹性，伴有明显肠道扩张、肠壁变薄变脆。H&E染色显示对照组回肠结构完整，模型组小鼠则出现粉红色条纹边变薄、绒毛缩短、上皮细胞排列紊乱、水肿、上皮细胞脱落、绒毛水肿、粘膜下层和固有层分离、部分绒毛坏死、炎性细胞浸润和血管充血。回肠组织学评分对照组为0-1分，模型组评分差异显著。评分≥2的小鼠纳入后续分析。
NEC小鼠中的m6A修饰
点印迹显示，NEC小鼠回肠组织中RNA m6A的整体水平显著高于对照组。IHC结果显示，m6A修饰主要位于细胞核，广泛存在于小鼠回肠组织的多种细胞类型中。NEC小鼠肠道组织中METTL3、METTL14、WTAP和FTO的mRNA水平显著升高。METTL3和METTL14的蛋白水平显著升高，WTAP蛋白水平下降，FTO蛋白水平无显著差异。以上结果表明，NEC中m6A修饰调节因子的表达存在失衡，导致回肠组织中整体m6A水平升高。
NEC婴儿中m6A峰的分布特征
MeRIP-Seq在NEC组中识别出19,242个m6A峰，涉及9,315个基因。对照组中识别出16,318个m6A峰，涉及8,520个基因，表明NEC组回肠组织的整体m6A修饰水平高于对照组。m6A修饰并非随机富集在mRNA上。绝大多数峰富集在靠近3'UTR区域的编码区（CDS）。基序分析显示，当识别长度为5个碱基时，两组中最可信的序列均为GGA(m6A)CU。在对照组中，52.72%的基因其mRNA上含有单个峰；NEC组中47.84%的基因含有单个峰。按功能域将mRNA转录本划分为CDS、5'UTR、3'UTR、转录起始位点（TSS）区域和终止密码子区域后，发现两组中CDS区域的峰比例最高（对照组45.99%，NEC组43.14%），其次是3'UTR和终止密码子区域。
差异m6A峰相关基因的功能分析
NEC组与对照组之间存在14,104个差异峰，对应8,957个基因。与对照组相比，NEC组中10,068个峰上调，对应6,869个基因；4,036个峰下调，对应3,357个基因。其中，1,269个基因同时存在上调和下调的峰。GO功能富集分析显示，差异峰基因主要富集于细胞大分子代谢过程、细胞内信号转导、小GTP酶介导的信号转导、细胞代谢过程等生物过程；与细胞内膜结合细胞器、细胞核、膜结合细胞器、细胞内部分、细胞内细胞器等细胞组分相关；并与结合、蛋白结合、离子结合、小分子结合、核苷酸结合等分子功能相关。
差异表达基因
基于RNA-seq中的基因表达水平，共检测到2,108个DEGs，包括1,070个上调基因和1,038个下调基因。GO功能富集分析显示DEGs显著富集于白细胞细胞间粘附、白细胞粘附正调控、白细胞迁移、白细胞粘附调控等生物过程。细胞组分主要与细胞外基质、蛋白质性细胞外基质、细胞外质膜区域、细胞质膜区室相关。分子功能显著与受体配体活性、受体调节活性、整合素结合、细胞因子受体结合相关。KEGG富集分析显示DEGs显著富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、白细胞介素-17（IL-17）信号通路、JAK-STAT信号通路、NF-κB信号通路等。Reactome富集分析显示富集于白细胞介素信号传导、IL-10信号传导、基质金属蛋白酶激活、细胞外基质组织等。
MeRIP-seq和RNA-seq数据的整合分析
四象限图显示了m6A甲基化与mRNA表达之间的关系。结果显示，363个基因呈现m6A超甲基化和转录上调（RNA_up_MeRIP_up），192个基因呈现m6A超甲基化和转录下调（RNA_down_MeRIP_up），150个基因呈现m6A低甲基化和转录上调（RNA_up_MeRIP_down），136个基因呈现m6A低甲基化和转录下调（RNA_down_MeRIP_down）。这些基因被称为差异m6A修饰的DEGs。
对差异m6A修饰的DEGs进行GO和KEGG通路富集分析，结果表明这些基因与白细胞迁移、白细胞细胞间粘附、细胞粘附正调控等生物过程相关，并显著富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号通路、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体相互作用等通路。为进一步研究不同类别差异m6A修饰DEGs（RNA_up_MeRIP_up, RNA_down_MeRIP_up, RNA_up_MeRIP_down, RNA_down_MeRIP_down）涉及的通路，分别对每组进行GO和KEGG通路富集分析。结果显示，RNA_up_MeRIP_up基因可能与NF-κB信号通路相关，而RNA_down_MeRIP_up基因则富集于扩张型心肌病（DCM）、粘着斑、ECM-受体相互作用等通路。
PPI网络构建与核心基因鉴定
利用STRING数据库为差异m6A修饰的DEGs构建了PPI网络。采用cytoHubba插件中的最大团中心性（MCC）算法，识别出前10个核心基因，包括IL6（RNA_up_MeRIP_down）、CXCR4（RNA_up_MeRIP_up）、ICAM1（RNA_up_MeRIP_down）、CXCL12（RNA_down_MeRIP_up）、MMP9（RNA_up_MeRIP_up）、HIF1A（RNA_up_MeRIP_down）、CD44（RNA_up_MeRIP_up/down）、APOE（RNA_down_MeRIP_up）、THBS1（RNA_up_MeRIP_up/down）和PTPRC（RNA_up_MeRIP_up）。这些发现突出了这些基因在m6A介导的NEC发病机制中的关键作用。
NEC中CXCR4的表达
鉴于NEC肠道组织中整体m6A水平升高，且CXCR4是一个具有m6A修饰增加的差异表达基因，并与细胞因子、细胞因子受体和炎症通路密切相关，推测CXCR4可能在m6A介导的NEC发病机制中起关键作用。免疫组织化学（IHC）染色显示CXCR4主要定位于细胞膜，尤其在隐窝细胞中，NEC组织中的表达显著更高。这些结果表明，m6A修饰可能通过调控CXCR4信号通路激活NEC中的炎症反应。
讨论
本研究采用序贯策略探索m6A在NEC中的作用。鉴于假说的探索性质及临床样本稀缺性，首先利用小鼠模型有力证实了整体m6A失调，这为对有限的人类NEC标本进行靶向m6A测序提供了依据，并确定了CXCR4作为关键候选分子。最后在小鼠模型中验证了该靶点，确认其一致性上调。这一步验证了模型的临床相关性，确立了其作为未来研究“m6A-CXCR4轴”机制的重要平台，这类研究在患者中是不可行的。
作为mRNA上最丰富的修饰，m6A修饰主要由甲基转移酶和去甲基酶调控。本研究发现m6A修饰广泛存在于小鼠回肠组织的多种细胞类型中，NEC小鼠组织中m6A水平和METTL3/METTL14蛋白表达显著升高。FTO表达不变提示NEC小鼠回肠中的m6A调控可能主要依赖于METTL3/METTL14。本研究观察到NEC样本中WTAP mRNA水平升高但蛋白水平下降，这种差异可能归因于转录后调控。TLR4是NEC发病机制中的关键介质，可被病原体激活诱导IFN-I表达。值得注意的是，Ge等人证明IFN-I信号激活通过K48连接的多聚泛素-蛋白酶体途径触发WTAP降解。这一机制为观察到的WTAP转录与蛋白表达解偶联提供了合理解释。
本研究首次绘制了人类NEC回肠中的m6A全景图谱，发现人类NEC回肠组织中整体m6A修饰水平升高，与小鼠NEC结果一致。人类回肠组织中的m6A修饰在CDS区域比例最高，主要富集在3'UTR和终止密码子附近区域，这与先前研究一致。本研究对RNA-seq和MeRIP-seq进行相关性分析，以探索NEC中可能受m6A调控的基因。结果显示大量受调控基因表现为RNA_up_MeRIP_up基因，表明m6A修饰增加了mRNA稳定性；其次是RNA-down_MeRIP_up基因，表明m6A修饰促进了mRNA降解并降低了mRNA表达。以上结果表明m6A修饰对靶基因具有选择倾向性和调控复杂性。
NF-κB是炎症反应的关键调节因子，是整合多种炎症信号通路的中心枢纽。本研究中，KEGG通路分析显示可能受m6A调控的基因主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号通路、病毒蛋白与细胞因子及其受体的相互作用、粘着斑以及NF-κB信号通路。RNA_up_MeRIP_up基因主要与NF-κB信号通路相关。推测NEC中的NF-κB信号通路可能受m6A修饰调控，但具体调控机制尚不清楚，需进一步研究验证。靶向m6A修饰过程以调控NF-κB信号通路可能是预防和治疗NEC的一个靶点。
先前研究表明CXCR4在结肠炎中高表达。使用CXCR4拮抗剂可缓解葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎，减少结肠组织炎症浸润，下调TNF-α和IFN-γ的表达，并通过调节紧密连接蛋白claudin的表达改善肠道屏障功能。CXCR4是识别CXCL12的特异性受体，研究表明CXC12/CXCR4通路在肠道炎症性疾病中起重要作用。研究发现NEC患儿血浆和腹腔灌洗液中CXCR4和CXCL12的浓度显著高于无肠道炎症的儿童。然而，CXCR4通路在NEC中的机制尚不清楚，CXCL12与CXCR4在NEC中的相互作用机制仍需进一步研究证实。研究发现，在人脐静脉内皮细胞中沉默METTL14可下调CXCR4的mRNA表达、mRNA上的m6A修饰和蛋白表达，提示METTL4通过促进CXCR4 mRNA的m6A修饰使CXCR4 mRNA更稳定，且METTL14/CXCR4轴可加剧TNF诱导的内皮细胞炎症。本研究通过分析MeRIP-seq与RNA-seq的关联，发现CXCR4属于RNA_up_MeRIP_up基因。IHC染色证实CXCR4在NEC肠道组织中高表达，提示m6A修饰可能增加了CXCR4 mRNA的稳定性，减少其降解，并提高了CXCR4蛋白的表达水平。上述结果表明CXCR4通路的激活参与了NEC的发生发展，而m6A修饰可能是NEC中CXCR4信号通路异常激活的表观遗传调控机制。
结论
本研究利用小鼠NEC模型，首次证实了NEC肠道组织中m6A修饰水平升高及甲基转移酶METTL3/METTL14表达上调。随后，绘制了首个人类NEC回肠m6A修饰全景图谱，结果识别出可能受m6A调控的潜在靶基因和信号通路，揭示m6A修饰可能通过调控CXCR4信号通路参与NEC发病机制。靶向m6A修饰过程代表了NEC预防和治疗的潜在新策略。然而，本研究并未完全阐明甲基转移酶-m6A-CXCR4轴在NEC中的精确分子机制。
