引言
近年来，水凝胶因其可调控的物理化学性质、高含水率和优异生物相容性，作为药物递送系统（DDS）的多功能平台受到广泛关注。这些特性使其在生理环境中保持结构稳定性，并促进与生物组织的相互作用。通过引入功能基团或动态交联剂，水凝胶能够对pH、温度或光等刺激产生响应，从而实现药物释放的精准时空控制——这对提高疗效和减少全身副作用至关重要。
在众多水凝胶材料中，纤维素基体系因其来源丰富、可生物降解、成本效益高和载药能力强而备受青睐。然而，传统纤维素水凝胶通常仅依赖药物的物理包埋，这限制了通过被动扩散实现持续释放的控制。为解决这些局限性，本研究开发了一种基于醛基化TEMPO氧化纤维素纳米纤维（A-TOCNF）和 glycol chitosan（GC）的pH响应型药物共轭水凝胶体系。该体系利用A-TOCNF中的醛基与 doxorubicin（DOX）的胺基形成动态亚胺键（Schiff base），实现pH触发的共价药物释放。
材料与方法
材料
TEMPO氧化纤维素纳米纤维（TOCNF, 2 wt %水溶液）购自DKS Co. Ltd.，glycol chitosan（GC, ≥ 60.0%）购自Santa Cruz Biotechnology。其他试剂包括 sodium periodate（MW = 213.89 g/mol, > 99.5%）、ethylene glycol（MW = 62.07 g/mol, > 99.5%）、phosphoric acid（PA, MW = 98.00 g/mol, > 85.0%）、hydrochloric acid（HA, MW = 36.46 g/mol, > 36.0%）、formic acid（FA, MW = 46.03 g/mol, > 98.0%）、α-mangostin（α-MS, MW = 410.46 g/mol）、dimethyl sulfoxide（DMSO, MW = 78.13 g/mol, > 99.0%）、acetic acid（AA, MW = 60.05 g/mol, > 99.0%）和 doxorubicin hydrochloride（DOX, MW = 579.98 g/mol）均来自富士胶片和光纯药株式会社，使用前未进一步纯化。
仪器
傅里叶变换红外光谱（FT-IR）使用日本分光株式会社FT/IR-6100在400-4000 cm–1范围内测定。场发射扫描电子显微镜（FE-SEM, JSM-6510）在加速电压1-3 kV和发射电流10 μA条件下获取样品图像，样品通过冷冻干燥凝胶制备。
醛基化TEMPO氧化纤维素纳米纤维的制备
参照文献方法，通过高碘酸盐氧化TOCNF制备醛基化TEMPO氧化纤维素纳米纤维（A-TOCNF）。将0.5 wt % TOCNF分散于水中，按0.50 mmol g–1纤维素添加 sodium periodate，在60°C、1000 rpm搅拌下避光反应24小时。反应结束后加入 ethylene glycol（30 μL g–1纤维素）淬灭反应，室温继续搅拌1小时，最后用12-14 kDa截留分子量的透析膜对去离子水透析3天，冷冻干燥得到A-TOCNF。
含酸/无酸药物交联水凝胶的合成
将3 wt % A-TOCNF溶液溶于蒸馏水，DOX（8 mg/mL）和α-MS（4 mg/mL）分别溶于DMSO。取200 μL A-TOCNF溶液与20 μL DOX或α-MS溶液滴加混合后，加入50 μL蒸馏水或酸溶液（AA、HA、PA、FA浓度0.01M、0.1M、1M、5M），最后加入200 μL 3 wt % GC溶液，分别获得含酸药物水凝胶（Drug-acid-hydrogel）和无酸药物水凝胶（Drug-hydrogel）。通过5000 rpm离心10分钟分离液相得到水凝胶。
药物负载效率
通过紫外-可见分光光度计（V-750, JASCO Corp.）测定水凝胶上清液吸光度，计算药物负载效率。DOX检测波长478.5 nm，α-MS检测波长326.8 nm。负载效率计算公式为：负载效率（%）= (L0- L1)/L0× 100，其中L0为初始添加药物总量，L1为上清液中未负载药物量。
药物释放测试
将水凝胶置于pH 7.0磷酸盐缓冲液或pH 2.0盐酸溶液中，定时取样测定吸光度，计算累积释放率。释放率计算公式为：释放率（%）= Rt/RL× 100，其中RL为水凝胶封装药物总量，Rt为时间t的释放量。
原子力显微镜测量
使用商用AFM系统（Park Systems Co., NX7）进行力-距离（FD）曲线测定。采用弹簧常数2.8 ± 0.2 N/m、针尖半径30 nm的SD-R30-FM探针，通过Hertz模型拟合获得水凝胶的杨氏模量值。
细胞实验
通过WST-8法评估Colon26细胞活力。将细胞以1.0 × 105cells/well密度接种于48孔板，与水凝胶共孵育24小时后测定450 nm吸光度，量化细胞存活率。
结果与讨论
质子化环境对DOX负载效率的影响
比较不同酸催化剂下的DOX负载效率发现，无酸添加时负载效率最高（96.3%），而 acetic acid（AA）、hydrochloric acid（HA）、formic acid（FA）和 phosphoric acid（PA）分别使效率降至75.8%、40.8%、42.8%和28.9%。表明过量质子化会使亚胺键平衡向醛基和胺基解离方向移动，降低DOX的共价固定化程度。强酸或多价酸还会增加水凝胶交联密度，减小网格尺寸，限制分子扩散过程。
酸催化剂浓度对DOX负载效率的影响
随酸浓度升高，DOX负载效率呈下降趋势。AA在0.01 M和0.1 M时保持高负载效率（96.7%、95.4%），但在1 M和5 M时降至73.2%和70.4%。HA和FA在0.01-0.1 M时效率最高，≥1 M时显著降低。PA下降最明显，从0.01 M的96.9%降至5 M的28.7%。表明过强酸性条件会 destabilize 亚胺键，促进水解反应。PA在0.1 M时效率低于其他酸，提示其分子尺寸会 sterically 干扰DOX扩散。
水凝胶的化学结构分析
FTIR光谱显示，含酸催化剂的水凝胶在1645 cm–1出现亚胺键（C=N）特征吸收峰，证实A-TOCNF醛基与GC胺基成功交联。无酸催化剂样品则未检测到亚胺键，1610 cm–1处醛基（C=O）吸收峰保持不变。DOX负载后，1726 cm–1处醛基峰消失，表明A-TOCNF与DOX形成亚胺键，该反应在无酸条件下亦可自发进行。
酸催化与药物负载对水凝胶微观结构的影响
SEM图像显示，AA处理样品（含/不含DOX）呈现更致密的纤维网络结构，纤维间隙和孔径更小，说明酸催化促进了A-TOCNF与GC间的亚胺交联。DOX的加入未显著改变网络形貌，表明其主要作为分子客体存在于聚合物网格中。
pH依赖性药物释放行为
在pH 7条件下，DOX释放量极低（含AA 18.6%，无AA 10.2%, 6小时），归因于中性环境中亚胺键的稳定性。pH 2时累积释放显著增加（无AA 85.6%，含AA 68.8%），源于质子化诱导的亚胺键水解。含AA水凝胶释放较慢，与其更高交联密度和更 compact 网络结构相关。
基于力-距离曲线的纳米力学性能
AFM测定显示，含AA水凝胶的杨氏模量在药物释放前为439.845 MPa，pH 2释放后降至431.950 MPa，pH 7后为436.401 MPa。无AA水凝胶相应值为469.661 MPa（释放前）、422.446 MPa（pH 2后）和483.053 MPa（pH 7后）。表明酸性条件下亚胺键水解会降低力学刚度，而无交联保护的水凝胶更易发生酸降解。
药物释放机制提议
FTIR分析证实，pH 2处理后的DOX负载水凝胶在1726 cm–1重现醛基峰，说明亚胺键水解再生醛基。含酸催化剂体系存在A-TOCNF-GC亚胺交联，酸性环境下双路径 cleavage 减缓释放；无催化剂体系则伴随多糖链 acid hydrolysis，导致结构坍塌和加速释放。
胺基对药物负载与释放效率的影响
在温和酸性负载条件下（pH ≈6），含胺基的DOX负载效率达96.3%，而无胺基的α-MS仅59.4%。pH 7释放实验中，DOX释放率10.2%，α-MS达54.0%，凸显胺基介导的共价固定化对持续释放的关键作用。鉴于超过40%药物分子含胺基，该平台具有广泛适用性。
对Colon26细胞的细胞相容性评估
无药水凝胶在0.5、0.25、0.125 mg/mL浓度下细胞活力均>90%，证明良好生物相容性。DOX负载水凝胶呈现剂量依赖性细胞毒性，最高浓度（0.5 mg/mL）活力降至7%；α-MS因物理扩散也显示浓度依赖性抑制，但效果较弱。
结论
本研究成功开发了基于A-TOCNF/GC的可生物降解pH响应水凝胶药物递送平台。通过亚胺键化学实现了对含胺药物的选择性负载和酸触发释放，系统阐明了酸催化对网络结构、力学性能和释放动力学的调控机制。细胞实验验证了其生物安全性与治疗效力，为靶向递送系统设计提供了新思路。
