Saman Zavari|Sina Kheirabadi|Ji Ho Park|Mohammad Hossein Asgardoon|Alexander Kedzierski|Arian Jaberi|Anton M. Hjaltason|Yuanhui Xiang|Dino J. Ravnic|Amir Sheikhi
美国宾夕法尼亚州立大学化学工程系，大学公园，PA 16802
摘要 具有可调生物物理和生化特性的多孔生物材料已被广泛研究，用于引导细胞行为并利用身体的内在再生潜力。气凝胶因其超轻结构、高孔隙率和大表面积而成为组织工程中很有前景的多孔支架；然而，其有限的孔隙可调性可能阻碍细胞的有效渗透和功能性组织整合。为了解决这一持续存在的问题，我们开发了一种新型多孔生物材料——颗粒气凝胶支架（GAS），该支架由尺寸可调的明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）微粒组装而成，能够精确控制气凝胶内部的孔隙几何形状和相互连接的微米级空隙网络。GelMA水凝胶微粒通过挤压和光交联形成颗粒水凝胶支架（GHS），随后通过超临界二氧化碳干燥处理，得到具有可调孔隙微观结构和保持结构完整性的GAS。重要的是，重新水化的GAS在机械性能、流变学特性和孔隙特性方面与GHS相当。体外 分析和体内 皮下植入实验表明，随着微粒尺寸的增加，GAS支持逐渐更多的细胞渗透。进一步的体内 分析（使用后肢微穿刺手术模型）显示，随着微粒尺寸的增加，支架的血管化和血管成熟度也有所提高。这项工作为设计具有精确调控的细胞级相互连接孔隙的气凝胶提供了平台，从而实现快速的细胞渗透、组织整合和血管化。GAS可以作为多功能、即用型生物材料，应用于组织工程和再生医学。
引言 生物材料已被设计用来利用身体的再生能力，促进组织修复[1]、[2]。孔隙特性（如连通性和尺寸）对于增强组织再生至关重要，因为它们不仅调节细胞黏附[3]、渗透[4]、[5]和分化[6]，还调节氧气、营养物质和代谢物的交换[7]。多孔生物材料可以提供一个有利于原位 组织再生的环境[8]。此外，孔隙微观结构是生物材料血管化的关键决定因素[9]、[10]，而这仍然是再生支架临床转化的一个关键瓶颈。如果没有快速而强大的新生血管生长，细胞在氧气和营养物质扩散限制之外的存活将受到严重损害，从而限制了持久的组织形成和长期支架整合[11]。气凝胶是一类以其高孔隙结构、大表面积和生物相容性而闻名的生物材料，已在包括伤口愈合[12]、[13]、[14]和止血[15]、[16]，以及骨骼[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、神经[22]、[23]和肌肉[24]再生，以及药物输送[25]、[26]、[27]等广泛生物医学应用中得到应用。 气凝胶通常在提供精细调控的孔隙微观结构方面存在不足，而这对于编程细胞迁移和组织修复是必需的[28]、[29]。表S1（支持信息 ）总结了不同的孔隙工程方法及其对用于组织工程的气凝胶孔隙特性的影响。一种改变孔隙大小的策略是通过调整合成参数，例如聚合物/交联剂的类型或浓度；然而，这种方法可能会通过增加交联密度来减小孔隙大小并提高局部硬度[20]、[21]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]。将支架孔隙大小与局部微环境硬度分离对于调节细胞行为和命运以及促进快速细胞渗透至关重要[29]、[35]。作为调整气凝胶孔隙大小的另一种策略，采用了各种制造方法，如超临界干燥（SCD）和冷冻干燥，通常情况下，SCD得到的孔隙大小大于冷冻干燥[36]、[37]、[38]。此外，改变干燥方法的操作条件（如溶剂类型、超临界流体与溶剂的比例以及SCD中的减压速率，或冷冻干燥中的冷冻温度和冷却速率）也可以改变气凝胶的孔隙大小，如表S1所示。然而，在这些方法中，最终的气凝胶结构在很大程度上取决于操作条件，限制了孔隙特征的精确控制[7]。还使用了具有定义好的尺寸和结构的牺牲材料来调节气凝胶的孔隙大小[39]、[40]、[41]；然而，这种方法需要额外的步骤来去除牺牲材料[42]。因此，仍然存在一个未满足的生物医学需求，即开发出孔隙微观结构明确的气凝胶，这种气凝胶不依赖于聚合物浓度和交联密度，也不需要使用任何牺牲材料。
受到颗粒水凝胶支架（GHS）设计的启发，其中水凝胶微粒通过自下而上的方法组装并通过共价或非共价键交联/连接以形成大孔[5]、[43]，我们假设类似的原则可以用来制造具有定制孔隙特性的气凝胶。在这里，我们旨在使用微粒开发具有定制孔隙特性的颗粒气凝胶支架（GAS）。我们将使用不同尺寸的明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）微粒来获得可调节的GAS孔隙大小。我们将彻底研究细胞级孔隙如何影响这种新型气凝胶的物理和生物（体外 和体内 ）特性。
材料 来自猪皮的明胶A型（凝胶强度约300 g Bloom）、甲基丙烯酸酐（MAA）、三氯（1H,1H,2H,2H-全氟辛基）硅烷（F-硅烷）、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂（LAP）、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（0.25%）、柠檬酸缓冲液（pH = 6.0）、TWEEN® 20、Parafilm® M密封膜、一碱式磷酸钠、二碱式磷酸钠、无水四氢呋喃（THF）、尿素、叠氮化钠、荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（FITC-葡聚糖，2 MDa），
GelMA合成 根据我们之前发表的协议[44]，将预热的50°C DPBS（体积200 mL）与20 g明胶混合。明胶完全溶解后，缓慢向溶液中滴加16 mL MAA，以达到最终浓度8% v/v。用铝箔覆盖反应容器以防止光线照射。在50°C下反应2小时后，向反应容器中加入400 mL 50°C DPBS以停止反应。未反应的MAA和副产物结果与讨论 图1A展示了使用高通量逐级乳化微流控装置通过形成水包油乳液制备近单分散GelMA滴液的过程。图1B显示了使用不同步长（约8 μm、27 μm和60 μm）的微流控装置生成的小、中、大尺寸GelMA滴液的明场图像。这些滴液在油中的尺寸分布较窄（图1C），平均直径分别为27 ± 2 μm、92 ± 6 μm和189 ± 12 μm，结论 我们开发了具有可调相互连接细胞级孔隙的聚合物颗粒气凝胶，以克服传统生物医学气凝胶制造方法的局限性。我们的方法基于GHS的SCD技术，能够独立于聚合物浓度精确控制支架孔隙大小，且无需使用任何牺牲材料。我们制备了不同尺寸的GelMA水凝胶微粒，然后通过挤压和共价交联形成GHS，随后经过溶剂处理CRediT作者贡献声明 Arian Jaberi： 写作 – 审稿与编辑、数据分析。Alexander Kedzierski： 写作 – 审稿与编辑、实验研究、数据分析。Mohammad Hossein Asgardoon： 实验研究、方法学、初稿撰写、审稿与编辑。Yuanhui Xiang： 写作 – 审稿与编辑、数据分析。Ji Ho Park： 数据分析、实验研究、方法学、可视化、初稿撰写、审稿与编辑。Anton M Hjaltason： 写作 –利益冲突声明 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。利益冲突声明 ☒ 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。致谢 S.Z.和S.K.对这项工作做出了同等贡献。本出版物中的研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH ）下属的国家心肺血液研究所（NHLBI ）的支持，资助编号为R01HL167939（A.S.和D.J.R）。感谢Dorothy Foehr Huck和J. Lloyd Huck早期职业主席的支持（A.S.）。S.Z.和S.K.还感谢研究生院副院长兼院长 提供的学生持续奖学金支持。此外，还获得了其他支持打赏
