合成了一种新的混合模式混合固定相，随后使用BET分析、SEM、FTIR光谱和EDX分析对其进行了表征。4,4'-联苯在碳酸钾的存在下用乙基氯乙酸酯进行酯化，然后在NaOH的存在下用乙醇/水（9:1 v/v%）进行羧基化。产物与六水合硝酸镍反应，生成了含有镍的4,4'-联苯。新合成的固定相通过1H-NMR、13C-NMR、FTIR、EDX、FE-SEM、BET、粒径分布和XRD进行了全面表征，其特性与所提出的材料一致，并且最适合用作液相色谱中的新型分离介质。所得材料被填充在不锈钢柱中（长度200毫米，内径0.2毫米），使用浆料填充机进行填充，并作为液相色谱的分离介质进行了测试。新开发的柱子能够分离不同类别的分析物，如多环芳烃（PACs）、苯衍生物和一组核苷酸，在优化的流动相条件下（乙腈/甲醇/15 mM甲酸铵，比例为60/30/10 v/v%，pH 6.5，流速25 µL min−1），平均板数分别为272,100、243,000和244,800板/m。
引言
高效液相色谱（HPLC）是通常用于分析和分离多组分混合物的技术之一。HPLC分离模式根据分析物与固定相之间的相互作用类型进行分类。单一分离模式，如反相液相色谱（RPLC）、离子交换色谱（IEC）和亲水相互作用液相色谱（HILIC）已有大量报道，但这些模式的应用范围有限。最近开发了在单个柱子上运行的多种保留机制，以获得更好的分离效果和色谱性能。已经报道了各种类型的混合模式色谱（MMC），包括RPLC/HILIC、RPLC/IEC、IEC/HILIC和RPLC/IEC/HILIC。
通过HPLC实现快速高效的分离取决于所使用的分离介质的选择，其中固定相是HPLC的核心。已经记录了多种固定相，如手性固定相、化学键合的环糊精、分子印迹聚合物（MIP）单体和多糖手性固定相，用于广泛分析物的对映体分离。聚合物C18和C8固定相用于分离PACs。有机和聚合物单体、氟碳以及金属有机框架（MOF）改性的硅胶基固定相已用于分析生物样品，如核苷酸、蛋白质和肽。
由金属离子通过有机配体连接的微孔材料（称为MOFs）是最近开发的用于液相色谱的分离介质之一，因为它们具有显著的特点，如大表面积、高通量能力、均匀的结构孔隙、更好的分离效率以及出色的热稳定性和化学稳定性。微孔有机网络（MONs）是另一类先进的微孔材料，通过Sonogashira–Hagihara偶联反应从芳香炔烃和卤代单体合成。较大的表面积和可设计的拓扑结构使它们在催化、污染物去除、传感和气体储存过程等领域具有很大的潜力。微孔有机聚合物，包括具有内在微孔性的超交联多孔聚合物和多孔芳香框架，在最近和目前受到了广泛关注。MONs的显著特性使它们成为色谱分离和样品预处理的良好选择。任何色谱方法的性能都由固定相的物理化学性质决定。探索新的策略来制备与多种分离模式具有更好相互作用位点的新型MON基固定相非常重要，以提高MONs在MMC中的分离能力和选择性。
当前项目旨在通过合理设计、合成和表征新的MON基固定相来填补文献中的这一空白，以应用于混合模式HPLC。通过开发多功能固定相，本研究旨在提高对同时分析和研究的化学多样分析物的色谱分离的选择性、分辨率和效率。除了在操作便利性方面的技术贡献外，它还为分析科学界提供了战略性的补充，为药物、环境和生化研究中的复杂基质提供了更好的分离方法。本研究解决了材料设计中的潜在限制，并展示了MONs如何提高色谱分离性能。
材料与方法
化学品和试剂
4,4'-联苯（99%）、氢氧化钾（99.99%）、氢氧化钠（99%）、六水合硝酸镍（99.99%）和碳酸钾（99%）从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买。乙基氯乙酸酯（99%）和二甲基甲酰胺（DMF）（99.9%）从Heowns Biochemical Technology Co., Ltd.（中国天津）购买。HPLC级乙醇（99–100%）从Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国上海）获得。实验工作中使用了烧杯、分离漏斗、滤纸、铲子、滴管、特氟龙小瓶、锥形瓶、数字天平（Shimadzu ATY 224）和移液管。使用磁力搅拌器（Irmico，德国）进行搅拌。PAC、萘（99%）、氟苯（99%）、蒽（99%）、三苯（98%）和苯衍生物（如苯酚（99.9%）、乙酰苯（99%）、硝基苯胺（98.5%）、4-甲基-2-硝基苯胺（98%）和二甲苯（99.5%）从Sigma-Aldrich购买。核苷酸腺苷一磷酸（AMP）、尿苷一磷酸（UMP）、鸟苷一磷酸（GMP）、胞苷一磷酸（CMP）和尿苷二磷酸（UDP）从Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.获得。
含有镍的4,4'-联苯基固定相的制备
二甲基2,2'-[1,4-苯ylenebis(oxy)]二醋酸酯的合成
使用文献中报道的改进的三步程序合成了基于4,4'-联苯的固定相。二甲基2,2'-[1,4-苯ylenebis(oxy)]二醋酸酯（2）按照我们研究小组报告的程序合成。4,4'-联苯的酯化是在1.0 mmol的4,4'-联苯（1）溶解在无水DMF（10 mL）中进行的，然后加入碳酸钾（2.0 mmol）。在搅拌条件下逐滴加入乙基氯乙酸酯（2.2 mmol）。反应混合物在80 °C下处理12小时，冷却至室温后倒入冰水中。所得沉淀物过滤，用水洗涤，并在室温下真空干燥。化合物（2）的产率为81%。
二羧酸配体的合成
二甲基2,2'-[1,4-苯ylenebis(oxy)]二醋酸酯（2）（酯化的4,4'-联苯）悬浮在含有9:1（v/v%）乙醇/水的20 mL溶剂混合物中。向反应混合物中加入氢氧化钠（2.5 mmol），并在70 °C下回流2小时，生成二羧酸的钠盐（3）和乙醇作为副产品。二羧酸的钠盐在酸性环境中进行质子化以生成二羧酸配体。溶液冷却并用稀释的HCl酸化（pH约为2），所得沉淀的配体2,2'-([1,1′-苯基]-4,4′-二基bis(oxy))二乙酸（4）通过过滤收集，用水洗涤并干燥。化合物（4）的产率为78%。
基于4,4'-联苯的微孔有机网络的合成
羧基酸配体（4）在搅拌条件下分散在DMF（10 mL）中。向溶液中加入1.0 mmol的六水合硝酸镍[Ni(NO3)2·6H2O]，并在60 °C下处理24小时。所得的绿色沉淀物通过过滤收集，用乙醇洗涤以去除未反应的物种，并在120 °C下真空干燥12小时，生成含有镍的4,4'-联苯基微孔有机网络（5）。涉及所有中间体的整个合成方案如图1所示。化合物（5）的产率为76%。
通过各种中间体合成含镍联苯基MONs。最终产品的颗粒显微图像显示其尺寸非常大。因此，最终产品使用研钵和杵手动研磨20分钟，或直到出现细粉状。每隔5分钟使用显微镜拍摄图像。20分钟后，研磨对颗粒大小没有进一步影响，表明已经达到了最终的颗粒大小。通过将250 mg的研磨后的相分散在甲醇中制备了浆料。
HPLC装置的设置
连接了压力泵、手动进样器、溶剂脱气器、检测器和一个内径为0.2毫米的200毫米玻璃内衬柱，构建了HPLC系统。连接了UV-2075毛细管窗口检测器（Jasco，日本）、Shimadzu LC-10AD泵（日本）、Valco（美国德克萨斯州休斯顿）的C14W.05进样器（带有50 nL注射环）和Shimadzu DGU-14A膜脱气器。最终色谱结果使用Origin Pro8（美国马萨诸塞州北安普顿）进行评估。安装了Lab Solution（Shimadzu，日本）软件来处理色谱数据。使用Origin Pro 8.1分析所得的色谱数据。
柱子填充
使用浆料填充机通过压力渐变策略填充了不锈钢柱。浆料填充机的储液器中加入了固定相浆料。将一个带有1微米孔径筛网的出口联结器的自制柱子连接到浆料填充器（Altech，美国迪尔菲尔德，1L）。通过同时振动储液器和柱子在填充过程中提高了填充质量。填充器在20,000 Psi的压力下操作5分钟，然后在15,000 Psi的压力下操作15分钟。随后，柱子保持原位直到压力降至零。柱子从填充器上拆下，一侧连接到HPLC进样器，另一侧连接到UV检测器。选择了一组核苷酸、PAC和苯衍生物来评估新开发柱子的分离性能。储备样品溶液存储在4 °C以下。理论板数使用以下公式计算：
N = 5.54[tR/W(1/2)]^2
其中W1/2是半高处的带宽，tR是保留时间。
表征
使用Avance Bruker AM 300-MHz光谱仪和氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）对合成的配体进行结构确认。使用扫描电子显微镜（SEM，JSM 5910，JEOL日本）研究表面形态，使用傅里叶变换红外光谱（FT-IR，PerkinElmer，光谱版本10.5.1）研究表面官能团。使用颗粒大小分析仪（Mastersizer 3000，美国）、能量分散X射线（EDX，JSM-6390LV）和Thermo Electron（Waltham，MA，美国）Flash EA1112元素分析仪确定颗粒大小分布和元素组成。使用BEL-Japan（大阪，日本）的BELSORP-MAX进行了Brunauer–Emmett–Teller和Barrett–Joyner–Halenda（BJH/BJH）氮吸附/脱附分析。通过脱气获得了小于10^-3托的压力。
1H-NMR分析
化合物2,2'-([1,1'-苯基]-4,4'-二基bis(oxy))二乙酸（4）的1H-NMR光谱（图2）验证了其结构。在δ 7.52 ppm（J = 8.7 Hz，4H，ArCH-2,6,9,11）和δ 6.95 ppm（J = 8.7 Hz，4H，ArCH-3,5,8,12）处的两个芳香双峰表明了具有对称对位取代的联苯结构。在δ 4.68 ppm处的四个质子的单峰信号对应于连接芳香核与二乙酸部分的两个等效亚甲基（2CH2-1″,1‴）。由于在DMSO-d6中的氘交换，光谱中没有观察到羧酸（COOH）的质子。
13C-NMR分析
在DMSO-d6中的2,2'-([1,1'-苯基]-4,4'-二基bis(oxy))二乙酸（4）的13C-NMR光谱进一步确认了所提出的结构。在δ 170.81 ppm处的共振可以归因于位于2″,2‴位置的两个等效羧酸羰基碳。在δ 157.40 ppm处的信号对应于与醚氧原子（2ArC-1,10）键合的两个芳香季碳，而在δ 133.13 ppm处的共振是由于联苯核的剩余季芳香碳（2ArC-4,7）。芳香亚甲基碳出现在δ 127.71 ppm（4ArCH-3,5,8,12）和δ 115.27 ppm（4ArCH-2,6,9,11），这与对称对位取代的联苯系统一致。在δ 65.07 ppm处出现的信号可以归因于二乙酸连接物的两个等效亚甲基（2CH2-1″,1‴）。观察到的共振的数量和化学位移与分子结构一致，证实了目标化合物的成功合成。
13C NMR光谱显示了中间化合物“产品2”，该化合物已经由我们的一个研究小组报道，并对其进行了完整的光谱表征。我们没有重复相同的数据，而是引用了已发表的研究（参考文献44）中的1H NMR、13C NMR和质谱数据，这些数据是关于化合物（2）的。最终的含镍联苯MOF产物是一种配位复合物。由于Ni(ii)中心的顺磁性，传统的1H和13C NMR光谱不适合对该化合物进行可靠的结构分析。因此，无法获得该复合物的NMR数据。FT-IR分析
通过FT-IR扫描在4000–500 cm−1范围内分析了二羧酸配体和含镍4,4′-联苯固定相的表面官能团（图4）。在二羧酸配体的FT-IR光谱（图4A）中，2500–3300 cm−1范围内的宽峰是羧基O–H伸缩振动的特征模式。这个宽峰在含镍4,4′-联苯化合物的光谱（图4B）中不存在，表明与镍离子结合的羧基相关羟基参与了反应，从而证实了含镍4,4′-联苯化合物的形成。图4B中3400 cm−1处的谱带归因于来自硝酸镍六水合物的羟基O–H伸缩振动。
二羧酸配体（A）和含镍4,4′-联苯基固定相（B）的FT-IR光谱。镍与羧酸根的配位进一步通过含镍4,4′-联苯的FT-IR光谱中出现的特征性羧酸根伸缩带得到证实。1336 cm−1处的弱带对应于羧酸根（–COO–）的对称伸缩振动，而1510–1650 cm−1范围内的强而明显的带则归属于羧酸根的不对称伸缩振动。通过比较光谱A和B，进一步确认了产物的形成，在光谱A中观察到的羧酸基的特征性羰基（CO）伸缩带在光谱B中消失了。这种变化是由于羧酸的脱质子作用以及随后与镍离子的结合所致。两个光谱中都有几个共同的吸收带。1606 cm−1处的带归因于4,4′-联苯中存在的芳香环的CC伸缩振动。3037和3041 cm−1处的峰对应于芳香C–H伸缩振动，而2907和2919 cm−1处的带则归属于饱和C–H伸缩振动。总体而言，FT-IR结果为含镍4,4′-联苯基固定相的成功形成提供了强有力的证据。
常规纯化和额外纯化的4,4′-联苯基固定相的EDX图谱如图5所示。常规纯化的样品中C含量约为44.07%，O含量约为39.08%，Ni含量约为2.96%；而额外纯化的样品中C含量约为46.09%，O含量约为37.04%，Ni含量约为4.95%。Cl和Na杂质的存在表明，常规的洗涤程序不足以清除合成过程中第1步和第2步产生的杂质，这些杂质分别来自氯乙酸酯和NaOH。因此，最终产品经过额外的纯化处理，使用含有2-丙醇/水/0.1 M HCl（8:1:1 v/v%）的溶剂混合物洗涤了三次。额外纯化策略有助于去除钠离子和氯离子。图5B显示了额外纯化材料的EDX谱图，可以观察到钠离子和氯离子的峰值减弱。此外，使用Thermo Electron（Waltham, MA, USA）Flash EA1112元素分析仪进行的元素分析也证实了最终产品的成功洗涤。
本研究中的含镍4,4′-联苯固定相颗粒的碳负载量（46.09%）比文献中报道的先前研究中的要高得多。先前报道的固定相的碳负载量低于20%，导致其疏水性相互作用较弱。当前研究中固定相中较低的镍含量对其色谱行为没有显著影响，但它在固定相的混合模式性质中起到了有效作用。最终固定相的成分组成包括C约45.01%，H约13.07%，O约36%，Ni约5%，显示出碳、氢、氧和镍的平衡负载。
含镍4,4′-联苯颗粒的形态在图6中以SEM图像的形式展示了研磨前（A）和研磨后（B）的情况。研磨前的SEM图像表明颗粒具有结晶性质，而研磨后颗粒尺寸分布减小到亚3 µm范围，并且在显微图像（图6C）中显示出良好的颗粒分散性，这些特性使得这些颗粒适合作为液相色谱的固定相使用。在不锈钢柱中填充这种固定相相当具有挑战性，但经过精心改进的填充协议有助于成功填充颗粒。图6D展示了色谱分离后柱子的SEM图像。
通过氮吸附和脱附等温线获得的孔径分布数据表明含镍4,4′-联苯固定相的多孔性质。图7A显示了含镍4,4′-联苯材料的BET孔径分布图。含镍4,4′-联苯的平均孔径为346 Å（34.6 nm），平均孔体积为0.899 cm3 g−1，表明这种新材料具有微孔性质。因此，当前研究中合成的材料可以被视为微孔有机网络（MONs）。含镍4,4′-联苯的比表面积为211 m2 g−1。合成材料的孔径范围（25–370 Å）、孔体积（0.5–1 cm3 g−1）和比表面积（100–400 m2 g−1）与先前报道的固定相的值相符，甚至比之前的研究中的比表面积还要好，从而提高了不同类别化合物的分析物的色谱分辨率。
BJH脱附（dA/dD）孔面积（A）和颗粒尺寸分布（B）显示了最终固定相的颗粒尺寸分布。如图7B所示，最终固定相的颗粒尺寸小于3 µm。由于最终固定相的颗粒具有结晶性质，因此颗粒的大小、尺寸以及簇中晶体的数量决定了颗粒的大小，这又取决于合成过程。最终获得的颗粒尺寸非常适合用作LC柱的填充材料，在HPLC条件下表现出良好的色谱性能。在d (0.1)处的颗粒尺寸分布差异值为1.23 µm，在d (0.5)处为2.42 µm，在d (0.9)处为3.54 µm，如图所示，整体颗粒尺寸小于3 µm。
通过XRD分析探讨了固定相的结晶性质和结构完整性。XRD分析表明含镍MOF固定相具有结晶性质，因为图8中显示的XRD光谱中的所有峰都非常窄。此外，峰的模式和2θ范围内的峰分布与报道的含镍MOF材料的谱图非常吻合。谱图在2θ处显示的峰衍射角分别为18.95°、21.04°、22.89°、28.25°、29.39°、33.25°、38.95°和42.4°。
含镍联苯MOF固定相的色谱评估
将含镍4,4′-联苯颗粒装填在不锈钢柱中后，作为新的分离介质进行了评估。当前项目中开发的柱子用于分离包含PAC、苯衍生物和核苷酸的混合测试分析物。选定的PAC分析物包括苯、萘、荧光素、蒽和三联苯。选定的苯衍生物包括酚、乙酰苯酮、硝基苯胺、4-甲基-2-硝基苯胺和二甲苯，而选定的核苷酸包括AMP、CMP、GMP、UMP和UDP。通过应用不同的流动相组成优化了洗脱条件，以获得当前研究中开发的柱子的最佳色谱性能，优化后的洗脱条件为乙腈/甲醇15 mM甲酸铵（60/30/10 v/v%），pH值为6.5，流速为25 µL min−1，检测波长为214 nm。在三组测试分析物下分别进行了分离。使用加标程序确定了测试分析物的洗脱顺序。图9中的色谱图表明，在优化的流动相条件下，三组测试分析物得到了良好的分离效果，PAC、苯衍生物和核苷酸的分离效率分别为272 100 plates m−1、243 000 plates m−1和244 800 plates m−1。当前研究中使用的柱子获得的板计数和分辨率数据分别总结在表1和表2中。在同一天进行的三次运行以及连续三天在相同洗脱条件下进行的一次运行中，检查了相邻分析物对之间的分辨率，PAC、苯衍生物和核苷酸的平均分辨率分别为7.2、3.6和2.7（表2）。由于相邻峰之间的分辨率与固定相的化学性质有关，而固定相的性质相同，因此选择性将保持不变，分辨率也不会改变。从色谱图中可以看出，较早洗脱的峰比等度洗脱模式下的峰更尖锐。除了小颗粒和良好的填充协议外，固定相的化学性质对于提高分离效果也非常关键，因为分析物与流动相和固定相之间的精细相互作用是获得高分离效率和分辨率的关键参数。
使用乙腈/甲醇/15 mM甲酸铵（60/30/10 v/v%）在pH 6.5、流速为25 µL min−1、检测波长为214 nm、柱背压为72 bar、柱尺寸为20 cm长×0.2 mm内径的条件下，对（A）PAC、（B）苯衍生物和（C）核苷酸的色谱图进行了分析。表1总结了当前研究中柱子的分离效率，以平均N值计。
当前研究中柱子对三组分析物的分离效率
分析物
N值
分析物
N值
分析物
N值
苯
290 500
酚
252 500
AMP
219 500
萘
288 500
乙酰苯酮
252 000
CMP
219 500
荧光素
269 500
硝基苯胺
248 500
GMP
213 500
蒽
262 500
4-甲基-2-硝基苯胺
236 500
UMP
321 500
三联苯
250 500
二甲苯
226 000
UDP
250 500
表2
使用当前研究中的柱子计算的PAC、苯衍生物和核苷酸相邻分析物对之间的分辨率（R）
苯-萘
8.3
酚-乙酰苯酮
6.5
AMP-CMP
4.5
萘-荧光素
6.5
乙酰苯酮-硝基苯胺
1.8
CMP-GMP
1.5
荧光素-蒽
9.1
硝基苯胺-4-甲基-2-硝基苯胺
3.2
GMP-UMP
2.3
蒽-三联苯
4.8
4-甲基-2-硝基苯胺-二甲苯
3.1
UMP-UDP
2.4
平均
7.2
3.6
2.7
比较研究
将当前研究中新合成的固定相和所得柱子与文献中报道的其他固定相进行了比较，从以下几个方面进行了评估：分离效率
使用核壳颗粒、整体式固定相、微孔颗粒和C-18结合的硅胶整体式颗粒获得了高效且快速的HPLC分离效果。已经报道了对包含微孔颗粒、整体式和核壳类型的固定相的质量传递动力学的详细比较研究。在当前研究中，合成了含镍4,4′-联苯微孔有机网络，并在优化的洗脱条件（乙腈/甲醇/15 mM甲酸铵（60/30/10 v/v%），流速为25 µL min−1，柱背压为72 bar下作为分离介质进行了评估。如图6所示，颗粒的不规则形状和性质对于在流动通道中的填充床中创建类单体结构非常重要，而微观图像（图6C）中观察到的分布均匀的固定相颗粒对于获得良好的填充质量至关重要，这与聚集的颗粒形成对比。固定相颗粒的聚集性质是导致填充床性能不佳的主要问题之一，从而降低了传质动力学。在当前研究中，没有颗粒聚集的问题，填充质量的改善相当容易实现。如表1所示，当前研究中固定相的分离效率得到了提高，这归功于精细调整的化学性质，使其与选定的分析物有更好的相互作用以及高质量的填充。尽管颗粒大小略大于已报道的固定相，但亚3微米的颗粒大小表现出更好的色谱性能，这表明颗粒大小并不是色谱结果的唯一决定因素。当前研究的结果表明，除了颗粒大小外，在追求提高分离效率和其他分析性能指标（如分离效率、分辨率、容量因子、选择性和渗透性）时，还必须考虑其他参数。使用当前研究新开发的柱子，每米理论板数分别为PAC 272,100 m−1，苯衍生物243,000 m−1，核苷酸244,800 m−1。新开发柱子得到的核苷酸的板数远优于参考文献53中的结果。参考文献53中没有提供核苷酸的分离效率的数值，但可以从色谱图的峰宽轻松估算出各种核苷酸的N值（每米板数）。同样，使用当前研究的柱子得到的小分子（如苯衍生物）的平均N值（每米板数）也高于先前研究中的值（226,100 m−1）。
分辨率
计算了四对相邻峰之间的平均分辨率，并与市售柱子的分辨率进行了比较。计算了三类分析物中每对相邻峰之间的最小分辨率，其数值在表2中展示。PAC分析物、苯衍生物和核苷酸的平均分辨率分别为7.2、3.6和2.7（表2）。所有三组测试分析物的平均分辨率与在类似洗脱条件下报道的其他固定相的研究结果相当。同样，相邻峰对之间的平均分辨率也与市售固定相相当。当前研究的分辨率重现性非常好，日间和柱间评估的%RSD值小于0.5%，这是因为固定相的化学性质保持不变。对于由理想核壳颗粒填充的柱子组成的良好系统，可以观察到最小的h值（减小颗粒大小）为1.2。如果考虑一个内径为4.6毫米、长度为15厘米、填充有2.6微米核壳颗粒的柱子，每柱的最大N值为48,000。对于填充有2.2微米Halo核壳颗粒的1-氯-4-硝基苯，每柱的最大N值为37,500。市售填充有亚3微米颗粒的柱子的最大长度为15厘米。此外，较小的颗粒大小和良好的固定相填充质量对于获得良好的色谱参数也非常关键，因为分析物与流动相和固定相之间的精细相互作用是获得高分离效率和分辨率以及整体色谱性能的关键决定因素。当前研究的柱子尺寸为内径0.2毫米、长度20厘米。尽管颗粒大小相对较大，但使用当前研究的柱子仍实现了色谱变量的提高，这可能是由于分析物与固定相之间的有利化学性质和相互作用。因此，基于较大颗粒的固定相通过精细调整化学性质，一方面提高了渗透性，另一方面提高了分离效率和分辨率，从而改变了固定相的容量因子。
为了探索含有镍的微孔有机网络固定相的柱子在实际样品中的应用潜力，从分析化学的角度来看，柱子在分离效率、保留时间和柱背压方面的重现性非常重要，允许的%RSD值在可接受范围内。当前研究的柱子的重现性是根据标准程序对所有三组测试分析物进行评估的。使用相同的协议合成了三批相同的固定相，并将它们填充在三个尺寸相似的柱子中，以评估批次间重现性；而对于日间重现性，三个柱子中的一个是连续三天进行评估的。对于柱间重现性，三个柱子使用同一批材料填充并在同一天进行检查。柱间研究的平均板计数%RSD小于5%，日间小于2%，批次间小于6.5%，而柱间保留时间的平均%RSD小于3%（表3），这在分析化学的可接受范围内。使用当前研究中合成的同一批固定相填充的三个尺寸相同的柱子，检查了柱背压的柱间重现性，其%RSD为1.9%。同样，日间、日内和批次间的柱背压%RSD值分别为0.8%、0.2%和2.1%（表4）。
分析物
柱间
日间
批次间
N值/米
保留时间（分钟）
N值/米
N值/米
平均
%RSD
平均
%RSD
平均
%RSD
平均
%RSD
苯酚
252,500
4.1%
10.11
2.6%
252,400
1.8%
252,600
5.3%
乙酰苯酮
252,000
3.2%
11.71
1.9%
252,100
1.7%
252,200
5.7%
硝基苯胺
248,500
3.9%
12.01
2.1%
248,300
1.6%
248,400
4.5%
4-甲基-2-硝基苯胺
236,000
4.8%
13.41
2.2%
236,100
2.1%
236,200
6.5%
二甲苯
226,000
4.9%
14.80
2.8%
226,200
1.8%
226,100
5.1%
PAC
苯
290,500
4.2%
6.71
2.5%
290,400
2.1%
290,600
5.2%
萘
288,500
3.9%
8.83
2.1%
288,300
1.8%
288,400
5.3%
荧光素
269,000
3.7%
11.01
2.3%
269,100
1.5%
269,200
4.9%
蒽
262,000
4.3%
13.05
2.4%
262,200
1.6%
262,300
5.1%
三苯基
250,500
4.5%
14.72
2.7%
250,400
2.2%
250,600
6.1%
核苷酸
AMP
219,500
4.2%
6.81
1.8%
219,400
1.6%
219,600
6.3%
CMP
219,500
3.8%
7.40
2.0%
219,300
1.7%
219,200
6.2%
GMP
213,000
3.9%
7.52
2.1%
213,100
1.8%
213,200
5.9%
UMP
321,500
4.4%
8.61
1.9%
321,600
2.0%
321,400
5.8%
UDP
250,500
4.7%
9.53
2.7%
250,400
1.9%
250,600
6.4%
a
对于柱间重现性数据，使用了当前研究的固定相填充了三个尺寸相同的柱子，并计算了平均N值和保留时间；而对于日间重现性，仅在连续三天内评估了填充有当前研究固定相的柱子。同样，为了评估批次间重现性，使用相同的协议合成了当前研究的不同批次的固定相，并将其填充在尺寸相同的柱子中，以评估苯衍生物、PACs和核苷酸的分离情况。表4
平均柱背压数据，包括日间、日内、柱间和批次间的%RSD
日内
日间
柱间
批次间
平均
%RSD
平均
%RSD
平均
%RSD
柱背压（巴）
71
0.2%
73
0.8%
72
1.9%
73
2.1%
a
对于日间和日内数据，计算了在一天内三次以及连续三天内评估的填充有当前研究固定相的柱子的平均值。对于柱间压力数据，使用了相同尺寸的三个柱子，填充了当前研究的固定相，并计算了三个柱子的平均背压。同样，对于批次间压力数据，使用相同的协议合成了当前研究的不同批次的固定相，并将其填充在尺寸相同的柱子中进行了评估。
当前研究中实现的较低柱背压也是该项目的一个有利特点，这可能是由于与以往研究相比颗粒大小较大，因为较大的颗粒大小在降低板计数的同时提供了较低的柱背压。新开发柱子的固定相的渗透率是使用以下公式计算的：
(2)
其中η、Δp、L和µ分别是流动相的粘度、柱子的背压、柱子的长度和流动相的线速度。使用乙腈/甲醇15 mM甲酸铵（60/30/10 v/v%）溶液计算了柱子的渗透率（1.003 × 10−14 m2）。当前研究中柱子的渗透率与文献中报道的单体固定相相当。
为了评估柱子的稳定性，计算了柱背压的%RSD，数值在表4中给出，表明柱子在日内、日间、柱间和批次间的稳定性足够好。在优化的洗脱条件下，柱背压为72巴。
结论
合成了含有4,4′-联苯的镍基固定相。4,4′-联苯与乙基氯乙酸酯反应生成二甲基2,2′-[1,4-苯撑双(氧)]二乙酸酯，然后用氢氧化钠在乙醇和水的溶剂混合物（9:1）中处理，生成2,2′-([1,1′-联苯]-4,4′-二基双(氧))二乙酸。最后，将这种二羧酸配体与Ni(ii)硝酸盐在DMF中处理，生成了含有镍的4,4′-联苯金属有机框架。所得材料通过1H-NMR、13C-NMR、FTIR、EDX、FE-SEM、BET、颗粒大小分布和XRD进行了广泛表征，结果令人满意，并使用Alltech浆料填充器填充在不锈钢柱中。新开发的柱子在HPLC中实现了PACs、苯衍生物和核苷酸的分离，分离效率和分辨率得到了提高。使用优化的流动相（乙腈/甲醇/15 mM甲酸铵（60/30/10 v/v%），在pH 6.5和流速25 µL min−1的条件下，获得了更多的理论板数（PACs = 272,100 m−1，苯衍生物 = 243,000 m−1，核苷酸 = 244,800 m−1）。
作者贡献
Hira = 数据整理、正式分析和写作——原始草稿。Faiz Ali = 概念化、方法论、项目管理、资源、监督和验证。Muhammad Waqar = 软件监督、审查和编辑。Won Jo Cheong = 资源和审查。Munazzah = 正式分析和调查。Zeid A. AlOthman = 调查和资源。
利益冲突
没有需要声明的利益冲突。
数据可用性
支持本文发现的数据作为补充信息（SI）提供。如果需要进一步的数据，相应的作者将应要求提供。补充信息可获取。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d5ra08544f。
致谢
本研究得到了马拉坎德大学和巴基斯坦高等教育委员会（HEC）项目编号：20-14499/NRPU/R&D/HEC/2021的支持。作者感谢沙特阿拉伯利雅得国王沙特大学支持的正在进行的研究资助计划（ORF-2025-1）。
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