六氟环氧丙烷同系物暴露通过钙稳态失调和线粒体功能障碍损害人类精子功能

六氟环氧丙烷同系物（HFPOs）暴露通过钙稳态失调和线粒体功能障碍损害人类精子功能。HFPOs，尤其是六氟环氧丙烷四聚体酸（HFPO-TeA）和六氟环氧丙烷三聚体酸（HFPO-TA），通过干扰线粒体功能和钙稳态，损害人类精子的活力、存活率及受精潜能。HFPOs可抑制孕酮诱导的顶体反应和钙信号传导，其钙内流效应由CatSper通道介导。线粒体靶向抗氧化剂MitoQ可显著减轻HFPOs诱导的精子毒性。这些发现表明，HFPOs作为新兴生殖毒物，对男性生育力具有潜在风险。

论文解读：HFPO同系物通过钙稳态失调与线粒体功能障碍损害人类精子功能

全氟和多氟烷基物质（PFASs）已成为男性生殖健康领域的重要关注对象。传统PFASs，如全氟辛酸（PFOA）和全氟辛烷磺酸（PFOS），因具有明确的生殖与系统毒性而逐步被限制和淘汰，由此推动了替代型含氟化合物的开发，其中六氟环氧丙烷同系物（HFPOs）被引入作为PFOA的替代品。然而，越来越多的证据表明HFPOs同样具有显著的环境持久性，能够抵抗降解并沿食物链发生生物放大。动物研究显示HFPOs可在体内长期蓄积，并引发多器官毒性，包括肝脏线粒体能量代谢紊乱、心血管发育毒性、肠道菌群失衡以及血睾屏障破坏等。尽管已有研究提示HFPOs可能损害雄性生殖功能，但现有毒理学数据多来自动物模型，其对人类精子功能的直接影响及潜在机制仍基本未知。精子功能受钙离子（Ca²⁺）稳态、线粒体生物能量代谢与氧化应激的协同调控；既往研究证实PFOA可通过扰乱人精子Ca²⁺流、抑制CatSper通道活性以及诱导线粒体功能障碍来降低精子质量。鉴于HFPOs与PFOA结构相似且可能具有类似或更强的生殖毒性，研究人员开展了本研究，旨在系统评估HFPOs对人类精子功能的不良影响，并阐明其分子机制。

研究人员从南昌生殖医院招募了30名符合世界卫生组织（WHO）第5版《人类精液检查与处理实验室手册》正常精子标准的健康男性供者，所有供者签署知情同意书，研究方案经南昌生殖医院伦理委员会批准（伦理批准号：2021002）。每次独立实验随机选取至少3名供者提供精液，混合后均分至各组以保证精子数量并减少个体差异。研究方法主要包括：采用计算机辅助精子分析（CASA）系统评估精子总活力、前向运动力和存活率；用金霉素（CTC）染色评估自发及孕酮（P4）诱导的顶体反应；用人工粘性介质穿透实验评估精子超活化能力；用Fluo-4 AM进行细胞内Ca²⁺（[Ca²⁺]_i）荧光成像，并利用CatSper抑制剂NNC 55–0396验证通道依赖性；用透射电子显微镜（TEM）观察精子超微结构；通过JC-1染色检测线粒体膜电位（ΔΨm）；用DCFH-DA和MitoSOX Red分别检测总活性氧（ROS）和线粒体ROS（mtROS）；通过发光法检测ATP含量；此外还整合了基于数据非依赖性采集（DIA）的定量蛋白质组学和非靶向代谢组学分析，以解析分子层面的扰动特征。

研究结果如下：

**HFPOs暴露显著损害人类精子活力和存活率。** 研究人员将精子暴露于不同浓度的HFPO-DA、HFPO-TeA和HFPO-TA后，CASA检测显示总活力和前向运动力呈浓度和时间依赖性显著下降；伊红染色证实高浓度HFPO-DA以及中高浓度HFPO-TeA和HFPO-TA可降低精子存活率。这表明HFPOs直接损害人精子基本运动参数。

**HFPOs抑制孕酮诱导的顶体反应、粘性介质穿透能力和鞭毛波形。** CTC染色结果显示，高浓度HFPO-DA、中高浓度HFPO-TeA和HFPO-TA均显著抑制P4诱导的顶体反应，HFPO-TA还同时抑制自发顶体反应。穿透实验表明HFPOs降低P4增强的精子穿透粘性介质的能力。鞭毛波形分析显示HFPO-TeA和HFPO-TA降低鞭毛摆动幅度，破坏获能精子特有的不规则搏动模式。这说明HFPOs干扰精子获能和受精相关功能。

**HFPOs破坏人类精子线粒体结构。** TEM观察显示，HFPO-DA引起顶体膜肿胀，HFPO-TeA导致顶体膜结构崩解，HFPO-TA使精子颈部线粒体排列紊乱；鞭毛横截面显示HFPO-TeA和HFPO-TA导致线粒体嵴断裂、线粒体鞘空泡化，并伴有外周致密纤维排列异常或不对称，部分轴丝出现“9+2”微管结构紊乱或中央微管缺失。这表明HFPOs可造成精子线粒体及鞭毛骨架的超微结构损伤。

**HFPOs诱导ROS过度产生和线粒体损伤。** 荧光定量显示，中浓度HFPO-TeA和HFPO-TA处理2小时后，精子总ROS升高至对照组的150%–170%，线粒体ROS升高至1.7–2.0倍；JC-1检测显示ΔΨm较对照组降低1.4–1.6倍；HFPO-TA暴露使精子ATP含量降至对照组的2.1倍以下。这些结果说明HFPOs打破精子氧化还原平衡，损害线粒体能量代谢功能。

**MitoQ阻断HFPOs诱导的线粒体功能障碍。** 补充线粒体靶向抗氧化剂MitoQ（100 nM）可显著缓解HFPO-TeA或HFPO-TA引起的精子总活力和前向运动力下降，同时降低总ROS和线粒体ROS水平，并恢复ΔΨm。这证实线粒体氧化损伤是HFPOs精子毒性的关键环节。

**HFPOs经CatSper通道诱导人精子[Ca²⁺]_i内流。** 以P4作为阳性对照，连续荧光记录显示500 μM HFPO-DA及各测试浓度HFPO-TeA和HFPO-TA均可诱导人精子产生瞬时[Ca²⁺]_i升高，随后逐渐恢复至基线水平；单精子成像进一步验证了该反应模式。使用CatSper通道抑制剂NNC预处理后，HFPOs触发的[Ca²⁺]_i上升被显著抑制，表明HFPOs诱导的钙内流依赖于CatSper通道。

**HFPOs抑制P4诱导的人精子[Ca²⁺]_i增加。** 在HFPOs预孵育后再加入P4，P4诱导的[Ca²⁺]_i峰值呈浓度依赖性降低；当HFPOs与P4同时给药时，[Ca²⁺]_i峰值高于单独HFPOs处理，但低于P4和HFPOs单独诱导峰值的加和。这提示HFPOs与P4可能在CatSper通道上存在竞争或部分激动关系，从而削弱P4的钙信号转导。此外，利用线粒体靶向Ca²⁺探针观察到HFPOs先引起快速线粒体Ca²⁺升高，随后出现持续性蓄积，提示病理性的线粒体Ca²⁺超载。

**HFPOs扰乱人类精子代谢组和蛋白质组图谱。** 非靶向代谢组学共鉴定出正离子模式923种和负离子模式1150种代谢物；与对照组相比，HFPO-DA、HFPO-TeA和HFPO-TA分别导致143、221和209个差异代谢物，富集通路各有特点，如HFPO-DA主要富集苯丙氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢，HFPO-TeA主要富集丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢及色氨酸代谢，HFPO-TA主要富集甘油磷脂代谢、精氨酸生物合成等。定量蛋白质组学共鉴定到101,521条肽段和7,405个蛋白；三种HFPO均扰动了钙信号通路、鞘磷脂信号通路、凋亡和脂肪酸代谢，但各自具有独特特征：HFPO-DA独特影响氮代谢和氧化磷酸化，HFPO-TeA选择性干扰碳代谢和鞘磷脂代谢，HFPO-TA则主要影响细胞黏附分子和柠檬酸循环（TCA循环）。多组学分析从分子层面解释了三种HFPO同系物功能毒性的差异性。

在讨论部分，研究人员指出，精子作为高度特化且DNA修复和抗氧化能力有限的细胞，对环境毒物尤为敏感。流行病学研究已显示PFAS暴露与精子数量、密度及活力下降相关。本研究的体外实验浓度设计高于高危人群血清中的实测水平，目的是放大毒理学信号以阐明分子途径，而非模拟真实暴露场景，且实际情况多为慢性低剂量累积暴露。研究人员强调，ROS在精子生理中具有双向作用，过量ROS可破坏线粒体膜结构并形成恶性循环；MitoQ恢复精子活力的结果支持线粒体功能障碍是HFPOs毒性的核心机制。对于Ca²⁺信号，HFPOs可能作为CatSper通道的激动剂，以竞争性方式干扰P4的生理信号，进而损伤精子获能和顶体反应。研究人员还基于时间序列证据提出，HFPOs首先经CatSper触发胞质Ca²⁺内流，随后驱动线粒体Ca²⁺超载和功能障碍，这一级联反应是HFPOs生殖毒性的重要机制。

研究结论部分翻译如下：总之，当前研究阐明了HFPOs可通过线粒体功能和钙稳态的双重扰动损害人类精子质量。这些发现加深了人们对环境毒物所致男性生殖缺陷的理解，并强调钙稳态是精子生理功能的关键决定因素。该研究也存在局限性：人类精子体外模型无法直接评估生育结局，从啮齿动物到人类的跨物种外推需谨慎；HFPOs与孕酮在CatSper通道上的竞争性或部分激动性相互作用目前仍属间接推断，未来需借助膜片钳记录、单分子成像或分子对接等技术进一步验证其直接作用方式。