林玉仪|梁浩|廖春萍|何玉军|胡银婷|彭子同|李志毅|陈兰梅|王永村|陈金灿
广东省医科大学附属医院肺肿瘤科，湛江，广东524023，中国
摘要
DNA损伤是癌症治疗中的关键途径，而调节细胞周期以抑制细胞增殖已成为重要的治疗策略。在这项研究中，设计并合成了两种以β-咔啉作为主要配体的钌(II)配合物：[Ru(phen)₂(1-(p-甲苯基)-9H-吡啶[3,4-b]吲哚)]PF₆（Ru1）和[Ru(phen)₂(1-(4-氯苯基)-9H-吡啶[3,4-b]吲哚)]PF₆（Ru2）。实验结果表明，这两种配合物在体外均表现出显著的抗肿瘤活性。它们能够与细胞核中的DNA结合，通过产生活性氧（ROS）诱导DNA损伤，并导致S期细胞周期停滞。此外，Ru1还能有效触发肿瘤细胞的自噬作用。最终，这些机制共同导致细胞凋亡。总之，我们报道了一种能够高效诱导DNA损伤、促进肿瘤细胞自噬和凋亡的钌配合物，从而展现出强大的抗肿瘤效果。这项工作为癌症治疗提供了新的策略。
引言
尽管顺铂是最广泛使用的金属基抗肿瘤药物，但其众多的副作用促使研究人员进一步探索其他金属制剂[1]、[2]、[3]、[4]。这也推动了非铂金属基治疗药物的发展[5]、[6]、[7]。其中，钌配合物因其独特的化学结构特征而被视为最有前景的抗癌药物之一[8]、[9]、[10]。某些钌配合物表现出良好的抗肿瘤活性，其细胞毒性甚至可与顺铂相媲美或更优。这些配合物具有高选择性，能够被肿瘤细胞有效摄取，并具有一定的抗转移能力[11]、[12]。作为潜在的抗肿瘤剂，越来越多的研究表明，钌配合物通过多种机制发挥抗肿瘤作用[13]、[14]、[15]。刘等人发现，一种吲哚配位的钌(II)芳烃配合物（InRu）能够靶向色氨酸2,3-双加氧酶的表达，从而增强肿瘤免疫治疗并防止免疫逃逸[16]。硒（Se）-钌（Ru）配合物（RuSe）可作为放射增敏剂，协同增强放疗杀死癌细胞的效果[17]。此外，Ru(II)能够引发内质网（ER）应激和细胞凋亡，将其结合到转铁蛋白中可提高生物安全性[18]。黄等人报道了一种具有强近红外（NIR）吸收特性的双核钌(II)配合物，可实现高效的抗癌光疗。该配合物能破坏癌细胞的氧化还原平衡和能量代谢及生物合成[19]。还有一种深红光触发的双三齿钌(II)光催化剂，通过干扰细胞代谢来对抗多重耐药性[20]。Samya Banerjee等人设计了一类光响应性钌(II)配合物，实现了有效的光动力抗肿瘤作用[21]。Johannes Karges等人设计并合成了一种以钌催化剂为中心的聚合物纳米反应器，该系统能在缺氧条件下催化谷胱甘肽（GSH）氧化为谷胱甘肽二硫化物（GSSG），从而产生活性氧（ROS）和脂质过氧化，最终导致癌细胞死亡[22]。到目前为止，已有四种基于钌的配合物进入临床评估阶段，分别是咪唑(二甲砜)四氯钌酸盐（NAMI-A）[24]、吲唑-四氯双(1H-吲唑)钌酸盐（KP1019）及其钠盐类似物KP1339（也称为IT-139或NKP-1339）[26]，以及基于Ru(II)的光疗剂TLD1433[27]。
β-咔啉生物碱是一类具有重要药理和生物活性的天然有机化合物。近年来，从β-咔啉骨架衍生出的合成化合物受到了全球研究人员的广泛关注。许多这类化合物表现出良好的生物活性，包括神经生物学效应以及多种药理作用，如抗肿瘤、抗疟疾、抗血栓、抗菌、抗骨质疏松、抗寄生虫和抗病毒作用[28]、[29]。另一方面，钌配合物不仅因其抗肿瘤效果而受到关注，还因其对正常细胞的低毒性和对癌细胞的高选择性以及抗转移潜力而受到重视。迄今为止，许多研究报道了金属配合物与β-咔啉药理结构的结合。这些混合制剂已被证明可以促进化疗、光动力治疗和联合光热化疗。此外，它们还能诱导DNA损伤并触发自噬等机制[28]。例如，我们之前的蛋白质组学研究显示，一种含有β-咔啉配体的Ru(II)配合物能够与线粒体ATP酶结合，从而促进肿瘤细胞死亡[30]。此外，Ru(II)–β-咔啉配合物可以与线粒体DNA相互作用，激活cGAS（环GMP–AMP合成酶）–STING（干扰素基因刺激因子）通路，增强抗肿瘤免疫[31]。另外，一种同时含有BODIPY衍生物和β-咔啉配体的配合物能够定位于内质网（ER）并阻断晚期ER自噬，从而增强该配合物（称为Re1）诱导免疫原性细胞死亡（ICD）的能力[32]。Tan等人的研究表明，一系列Ru(II)–β-咔啉配合物能够同时诱导肿瘤细胞的凋亡和自噬，这两种过程均通过活性氧（ROS）的积累来实现[33]。
钌配合物的抗肿瘤机制仍是一个活跃的研究领域。在过去几年中，我们的研究主要集中在阐明基于钌的抗肿瘤剂的机制，包括其设计、合成、结构修饰、生物学评估及潜在的分子途径[34]、[35]、[36]、[37]、[38]。我们观察到，对于β-咔啉衍生的钌配合物而言，主配体上的取代基对其抗肿瘤机制有显著影响。例如，-NO₂取代的Ru–β-咔啉配合物可以通过还原性损伤途径诱导肿瘤细胞凋亡。为了进一步研究取代基对这些配合物活性和机制的影响，我们设计并合成了两种新的β-咔啉基钌配合物：[Ru(phen)₂(1-(p-甲苯基)-9H-吡啶[3,4-b]吲哚)]PF₆（记为Ru1）和[Ru(phen)₂(1-(4-氯苯基)-9H-吡啶[3,4-b]吲哚)]PF₆（记为Ru2）。已知β-咔啉衍生物能够靶向核DNA并诱导DNA损伤，从而发挥抗肿瘤作用，并同时触发自噬。实验结果表明，这两种配合物在体外均表现出显著的抗肿瘤活性，对HeLa细胞具有明显的选择性。它们能够与核DNA结合，诱导ROS介导的DNA损伤，并导致S期细胞周期停滞。此外，Ru1还能有效触发肿瘤细胞的自噬。最终，DNA损伤和自噬共同促进了细胞凋亡。总之，我们报道了一种能够有效损伤DNA并促进肿瘤细胞自噬的钌配合物，从而展现出强大的抗肿瘤效果。这项工作为癌症治疗提供了新的战略方向。
合成与表征
配体1-(p-甲苯基)-9H-吡啶[3,4-b]吲哚（L1）和1-(4-氯苯基)-9H-吡啶[3,4-b]吲哚（L2）是根据先前文献方法合成的（图S1）[39]。简要来说，目标钌配合物的合成过程包括两个主要步骤：首先，[Ru(phen)₂Cl₂]与三氟甲磺酸银（AgOTf）在回流条件下反应3小时，生成关键的反应中间体；然后将此中间体与主配体（L1或L2）偶联
结论
总之，我们报道了两种能够有效且选择性地杀死HeLa细胞的β-咔啉钌配合物（方案2）。这些配合物在细胞内化后主要定位于细胞核，在那里它们与DNA结合并损伤DNA，从而抑制DNA复制。此外，这些配合物还能诱导HeLa细胞进入S期细胞周期停滞并触发自噬。以Ru1为例，我们证明了它诱导的自噬作用可以促进细胞凋亡。
CRediT作者贡献声明
林玉仪：撰写初稿、进行形式分析、概念构思。
梁浩：方法学设计、实验研究、资金获取。
廖春萍：数据管理。
何玉军：形式分析。
胡银婷：实验研究。
彭子同：软件操作。
李志毅：实验研究。
陈兰梅：撰写、审稿与编辑、方法学设计。
王永村：撰写、审稿与编辑、项目管理。
陈金灿：撰写、审稿与编辑、资金获取、数据管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号22207136）、广东省自然科学基金（编号2025A1515010381、2024A151501015）、广东省普通高校特色创新项目（编号2023KTSCX037）以及大学生创新实验计划（编号S202510571063）的支持。
