ABSTRACT
B族链球菌（Group B Streptococcus , GBS，即Streptococcus agalactiae ）是引起新生儿和成人侵袭性感染的主要病原体之一。成人胃肠道（Gastrointestinal tract, GI tract）是GBS无症状携带的一个研究不足的部位，可能与传播和疾病均相关。本研究建立了一种成年小鼠胃肠道GBS定植模型，为探究该生态位中的宿主-微生物相互作用提供了一个易于操作的体系。利用该模型，研究证实胃肠道携带可推广至多种GBS分离株，并利用转座子测序（Transposon sequencing, Tn-Seq）技术鉴定了对胃肠道定植重要的候选GBS因子。基于Tn-Seq数据，研究确定GBS荚膜是其成年小鼠胃肠道定植的关键因子。总之，这项工作强调了胃肠道作为GBS储库的重要性，并为进一步研究GBS胃肠道携带的细菌和宿主决定因素引入了一个新的实验框架。
INTRODUCTION
GBS是一种致病的革兰氏阳性细菌物种。它无症状地存在于成人胃肠道和女性生殖道，并在新生儿、孕妇以及非孕妇（尤其是免疫功能低下和老年人）中引起多种感染。尽管预防性干预措施降低了新生儿GBS发病率，但全球范围内非孕妇的GBS疾病发病率正在上升，这凸显了当前GBS预防措施和治疗的局限性，并强调需要开发针对GBS的新治疗策略。
当前的GBS疾病预防和治疗标准是使用抗生素。然而，单纯依赖抗生素存在严重且日益增长的担忧：首先，抗生素不能完全预防GBS疾病；其次，用于β-内酰胺过敏者的二线抗生素效果不如青霉素；此外，对青霉素和二线抗生素的耐药性正在增加，使所有人群面临风险。最后，关于抗生素过度使用及其已知不良反应（尤其是在新生儿中）的担忧日益增加。产时抗生素的使用与婴儿微生物组的显著改变有关，并可能对婴儿产生潜在不良影响。
本研究开发了一种小鼠模型，以开始理解研究不足的GBS胃肠道储库。值得注意的是，GBS无症状地携带在15-30%成人的胃肠道中。胃肠道GBS种群是社区传播的潜在来源，并可能诱发女性生殖道GBS定植。靶向胃肠道中的GBS首先需要更深入地了解GBS在该环境中的生理特性。本研究建立了首个报道的体内模型来研究成年哺乳动物肠道中的无症状GBS。
RESULTS
Murine GI carriage of GBS strain COH1
在建立模型时，研究考虑了饮食和抗生素使用两个重要的宿主决定变量。为了模拟西方生活方式的一个主要特征，给小鼠喂食缺乏纤维（Fiber-deficient, FD）的饮食，因为大多数美国成年人未能达到推荐的每日纤维摄入量，这种慢性缺乏会改变胃肠道的微生物群和代谢环境。此外，抗生素使用并非GBS携带的风险因素，表明GBS可以在没有大规模生态干扰的情况下侵入人类微生物组。因此，在接种GBS前未对抗生素预处理小鼠。
在用FD饮食喂养、未经抗生素处理的小鼠接种GBS菌株COH1后，通过粪便采样观察到GBS在小鼠胃肠道中长期定植长达2个月，总体GBS丰度存在波动。小鼠在任何时间点均未表现出疾病的行为迹象，这与GBS的长期无症状携带一致。
为了确认GBS胃肠道定植代表稳定种群而非短暂定植GBS的重复接种，研究将小鼠单独饲养在铁丝底笼中以限制食粪行为，发现与标准饲养条件下的对照小鼠相比，GBS负荷无差异。研究还测试了宿主生物学性别对定植的影响，发现雄性和雌性小鼠的GBS负荷无差异，这与人类调查数据一致。这些结果确立了该模型重现了成年胃肠道中稳健、无症状的GBS携带，且不受食粪行为或宿主生物学性别影响。
Generalizability of the model to other GBS strains
GBS菌株通常分为10种已知血清型（Ia, Ib, II–IX）。为了测试GBS胃肠道定植模型对其他常用GBS研究菌株（也反映了美国常见检测血清型）的普适性，研究用GBS菌株COH1（血清型III）、A909（血清型Ia）以及两种血清型V菌株（CJB111和超强毒力菌株CNCTC 10/84）定植小鼠。
与COH1类似，观察到CJB111和CNCTC 10/84可以在实验期间持续定植胃肠道，而A909的GBS水平较低，在接种后4天内降至检测限以下。粪便菌落形成单位（CFU）计数的曲线下面积（Area under the curve, AUC）比较进一步说明了这种差异，并强化了菌株间定植能力的差异。这些发现支持了GBS菌株间的遗传变异有助于其在成年胃肠道中的适应性。
Genome-wide analysis of GBS factors required for survival in the murine gastrointestinal tract
接下来，研究旨在鉴定GBS在 murine 胃肠道中定植和生存所需的遗传因子。利用现有的GBS转座子（Transposon, Tn）突变体库（CJB111血清型V背景）定植小鼠胃肠道。通过体内Tn-Seq，将测序读数映射到GBS CJB111基因组，鉴定出1,066个基因在盲肠内容物中与输入库相比显著偏低表达，12个基因显著偏高表达。
由于初始分析中显著偏低表达的基因数量庞大，进一步分析限制在显著偏低表达基因的前25百分位数内的基因。这些基因被分配了直系同源蛋白簇（Clusters of Orthologous Groups of proteins, COGs）。包括碳水化合物转运和代谢、氨基酸转运和代谢、核苷酸转运和代谢、无机离子转运和代谢以及细胞壁/膜/包膜生物合成在内的COG类别，在显著偏低表达基因的前25百分位数中拥有最多数量的基因。研究鉴定出多个已知有助于GBS感染和粘附的基因显著偏低表达，例如涉及β-溶血素/溶血色素的基因、双组分调控系统、菌毛基因以及金属碳水化合物转运基因。
在最显著偏低表达的基因中，有荚膜多糖合成基因座的基因。CJB111的V型荚膜生物合成途径如图所示。基因cpsXYABCD 是推定的荚膜调控和表面附着基因，其中六个基因中有五个位于数据集的前25百分位数。前25百分位数中的其他基因是cpsEF ，它们推定参与重复单元的生物合成。整体而言，这提示了荚膜在胃肠道生存中的重要性，其中生物合成途径中任何步骤的缺失都会导致GBS生存能力下降。
Loss of capsule leads to decreased GBS survival in the adult mouse GI tract
Tn-seq实验鉴定出荚膜生物合成基因座中的突变体在盲肠内容物存在的菌株库中显著偏低表达。为了测试荚膜在GBS胃肠道定植中的重要性，重复了定植实验，使用CJB111 ΔcpsD 突变体（与野生型相比荚膜丰度减少）。每日粪便采样显示荚膜突变体在胃肠道中的适应性较差，大多数ΔcpsD 定植的小鼠在采样期结束时GBS负荷低于检测限。对接种CJB111或CJB111 ΔcpsD 的小鼠粪便CFU计数的平均曲线下面积（AUC）比较进一步强化了荚膜在 murine 成年胃肠道定植中的作用。这些观察结果共同支持荚膜在维持成年胃肠道定植中的重要性。
DISCUSSION
B族链球菌是人类整个生命周期中的严重健康问题。虽然当前基于抗生素的干预和治疗有效，但抗生素耐药性的上升以及对抗生素介导的微生物组破坏的负面影响的日益认识，强调需要非抗生素方法来减轻GBS疾病。此外，近年来大多数侵袭性GBS疾病发生在非孕妇中。与新生儿和孕妇不同，对于主要通过社区传播获得GBS的非妊娠个体，尚无标准的预防方法。需要更多研究来了解GBS的社区储库——成人胃肠道。
本研究提出了一个稳健的GBS成年胃肠道定植模型，为更好地理解这种病原体在这一重要但研究不足的生态位中的特性铺平了道路，并确定荚膜多糖是定植所需的重要GBS编码分子因子。这为越来越多的文献做出了贡献，这些文献强调了荚膜对于GBS在各种宿主相关生态位中定植和引起疾病的重要性。研究观察到不同GBS菌株的适应性存在差异，A909（Ia血清型）的定植效果不如COH1（III）、CJB111（V）或CNCTC 10/84（V）。类似的菌株差异也在 murine 阴道定植模型中看到。CJB111和COH1具有不同的荚膜多糖（Capsular Polysaccharide, CPS）结构，使得这种主要表面暴露的大分子可能影响胃肠道定植的差异。然而，菌株间的非CPS遗传变异可能影响这些定植动态的差异，这突出了未来研究的一个重要领域。
10种抗原性不同的GBS CPS类型由葡萄糖和半乳糖的不同连接与末端侧链唾液酸组成。虽然荚膜调控基因和唾液酸合成基因在CPS类型间高度保守，但糖基转移酶的差异以及由此产生的糖结构可能有助于菌株在胃肠道和其他身体部位定植能力的差异。先前在新生 murine 肠道中的研究表明，野生型A909能够胜过工程化为CPS III的A909同基因突变体。这可能表明GBS荚膜多糖结构在未成熟新生儿肠道与成年肠道中的作用存在差异。
进一步支持荚膜在胃肠道定植中的重要性，通过体内Tn-seq显示，多个GBS CPS生物合成基因位于偏低表达基因的前25百分位数。随后研究表明，V血清型荚膜突变体在体内胃肠道中的定植程度无法达到野生型水平。需要更多工作来进一步探究CPS类型对胃肠道定植的影响。
输出库中其他显著偏低表达的基因包括分选酶srtC1 和srtC2 ，已知的粘附因子，如PI-2a菌毛和lmb （层粘连蛋白结合粘附素），它们促进上皮细胞和细胞外基质成分的定植和粘附。值得注意的是，先前被鉴定为在定植和毒力中重要的CovR/S转录调控系统并未显著偏低表达。相反，双组分系统TCS18（即PhoBR）位于偏低表达COGs的前25百分位数。TCS18似乎通过结合hylA 和ciaR 的启动子区域影响GBS生物膜形成和溶血素产生。先前在其他GBS身体部位（如女性生殖道、血流和糖尿病伤口溃疡）进行的CJB111 Tn-seq实验也鉴定出类似的毒力因子和双组分系统显著偏低表达。总之，这表明在其他身体部位实现定植和毒力的相同遗传因子可能也参与在胃肠道中建立无症状定植。
本研究的一个局限性是仅关注大肠（盲肠内容物和粪便），未研究胃肠道其他部位的GBS。这是因为大肠拥有胃肠道中最多的生物量。然而，众所周知，微生物组的生态学沿胃肠道长度变化很大。链球菌物种是口腔和小肠的标志性物种。虽然GBS已在口腔中分离到，但它并非主要成员。这可能表明GBS在这些生态位中被其他链球菌物种竞争排除，使得大肠成为GBS的首选胃肠道生态位。未来的工作将利用该模型确定GBS在整个胃肠道纵向上的生物地理分布，并确定在这些不同位置维持定植所必需的微生物和宿主因子。
这项工作也为进一步研究饮食如何影响胃肠道中的GBS奠定了基础。胃肠道是一个营养物质波动的镶嵌体，宿主饮食决定其可用性，进而影响细菌适应性。与其他链球菌物种一样，GBS的基因组较小（约2 Mb）。因此，GBS是许多必需化合物的营养缺陷型，主要依赖于从环境和其他细菌群落成员中获取。除了先前鉴定的毒力因子和双组分调控系统外，多种碳水化合物和氨基酸转运/代谢基因也偏低表达。值得注意的是，CJB111已知的葡萄糖苷酶并未显著偏低表达，这与饮食中缺乏纤维一致。这些基因在不同的饮食条件下可能更为关键。相比之下，糖摄取基因座（如celAB 和manN ）在数据集中偏低表达，表明在缺乏纤维饮食的小鼠胃肠道中，简单糖的代谢可能对GBS持久性更为关键。ManN 在阴道和糖尿病伤口溃疡Tn-seq中也偏低表达，表明其对GBS在不同身体部位的定植和发病机制具有共同重要性。
参与氨基酸代谢的基因ilvE （参与支链氨基酸代谢）和glyA （参与丝氨酸代谢）在胃肠道中也偏低表达。胃肠道中偏低表达的碳水化合物和氨基酸基因与阴道、血流和糖尿病伤口溃疡中的差异，提示了生态位特异性代谢活动的可能性。预计该模型将有助于集中研究如何利用宿主饮食作为一种非侵入性、非基于抗生素的干预措施，以降低GBS胃肠道定植率并减轻后续疾病。
预计该模型还将有助于未来研究GBS如何从胃肠道储库传播到其他身体部位（如泌尿生殖道）以及其他高危个体（如新生儿和免疫功能低下的成人）。GBS成人胃肠道定植易导致人类泌尿生殖道定植，该模型可用于探索驱动这种传播的细菌和宿主因子。此外，对孕妇的纵向直肠阴道筛查表明GBS状态可能是短暂的，提示短暂因素（如宿主行为和饮食）可能影响GBS负荷和传播风险。这在我们自己的发现中得到呼应，我们看到GBS负荷存在日常波动。未来的工作可能旨在解决驱动这种变异性的宿主和细菌因子。
成人胃肠道是GBS一个研究不足但至关重要的储库。更好地了解GBS在胃肠道中的生理特性对于开发靶向干预措施至关重要。本研究建立了一个稳健的成年小鼠模型，该模型重现了关键的人类宿主因素，如与性别无关且不需要抗生素预处理。该模型为从机制上剖析GBS如何在肠道中持续存在，以及这如何影响其他身体部位的携带、向新生儿的传播以及随后的新生儿和成人疾病打开了大门。
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