综述：用于氧化还原成像的光学探针：荧光、生物发光和化学发光技术在体内检测活性氧（ROS）、RNA（RNS）和RNA相关物质（RSS）方面的比较研究

本文系统比较了荧光、生物发光和化学发光探针在炎症性疾病中实时检测ROS、RNS和RSS的应用，分析其设计原理及优势，指出生物发光和化学发光探针在降低背景噪声、延长半衰期方面的潜力，为优化探针设计提供参考。

王宇涵|李晓宇|王向东|王鹏|陈振|杨静

中国药科大学工程学院，南京210009，中国

摘要

活性氧（ROS）、活性氮（RNS）和活性硫（RSS）在持续的炎症反应中过量产生时，会导致氧化应激，并引发各种急性和慢性疾病。监测这些分子对于理解病理机制和评估治疗效果至关重要。本文系统地比较了用于炎症疾病中ROS、RNS和RSS 体内成像的荧光、生物发光和化学发光探针。在过去十年中，每种方法都发展出了独特的优势：荧光提供了高分辨率的实时可视化；生物发光能够在超低背景下实现深层组织成像；而化学发光则允许直接、无需激发的检测氧化还原活性。为了澄清这一领域的情况，我们采用“构建块”逻辑来分析这些探针的设计原理和演变轨迹。重点关注炎症及相关疾病模型，我们强调了生物发光和化学发光探针在实时监测氧化应激方面的变革潜力。这项工作为选择和创新氧化还原生物学中的光学探针提供了结构化的指导。

引言

作为调节代谢和参与免疫反应的信号分子，活性氧（ROS）、活性氮（RNS）和活性硫（RSS）在生理过程中起着至关重要的作用。然而，在慢性炎症期间，它们的失调会导致氧化应激，并引发神经退行性病变、癌症、糖尿病等疾病[1]、[2]、[3]。因此，监测ROS、RNS和RSS的动态对于解码相关的生理和病理途径至关重要。

ROS是一类含有氧的化学活性物质，具体来说，它们是一组通过电子转移反应从O₂在细胞中产生的活性物质，包括次氯酸/次氯酸盐（HOCl/ClO⁻）、过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子自由基（O₂^•-）、羟基自由基（·OH）和单线态氧（¹O₂）。RNS是另一类重要的化学活性物质，它们通过硝基化作用破坏细胞，具体包括一氧化氮（NO）、过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）、亚硝基氮（HNO）和二氧化氮（NO₂）。RSS是一类含有硫元素的化合物，包括半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH）、硫化氢（H₂S）、二氧化硫（SO₂）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）和硫自由基（RS•）以及多硫化物（H₂S_n，n ≥ 2），这些化合物参与生物系统中的信号传导、抗氧化、酶活性调节、抗炎和细胞保护等多种功能（图1）。这些高活性分子的过量产生会导致分子和细胞损伤，促进炎症，并引发各种疾病[4]、[5] [6] [7]。

可视化这些信号分子有助于研究人员和医生更好地理解病理过程[8]、[9]。检测这些分子还有助于追踪药物效果：处理过的细胞中ROS的变化反映了氧化应激和毒性，有助于药物筛选和优化。临床上，此类检测通过根据患者反应指导治疗调整，支持个性化医疗。

由于荧光探针具有高灵敏度、快速响应和出色的空间分辨率[10]，因此被广泛使用。已经开发出许多针对ROS、RNS和RSS的荧光传感器，利用特定的反应机制在炎症微环境中实现快速检测。荧光团的选择（如罗丹明、香豆素、萘酰亚胺或硼二吡咯甲烯（BODIPY）决定了其光学特性和选择性，激发/发射波长是关键的设计参数。然而，信号干扰、背景噪声和稳定性差等问题常常限制了它们在复杂生物系统中的应用。体内情况下，组织的光散射和吸收会进一步降低信号强度并增加背景噪声。

相比之下，生物发光和化学发光探针表现出更优越的性能。生物发光探针利用天然存在的发光反应（通常涉及荧光素酶）来实现炎症信号分子的实时监测。由于具有高生物相容性和在活体生物中的最小干扰，它们在体内成像和疾病监测方面显示出巨大潜力。

化学发光探针通过化学反应产生光，无需外部光源，大大降低了背景噪声。它们的高信号强度使得在低浓度下也能进行敏感检测。大多数化学发光探针会经历氧化反应形成不稳定的过氧化物，这些过氧化物在返回基态时释放光子[11]。常用的底物包括鲁米诺及其衍生物[12]、[13]、1,2-二氧杂环烷[14]、[15]、过氧草酸酯、吖啶酯[16]和咪唑吡嗪酮[17]。根据能量转换机制，化学发光可分为直接型和间接型[18]。在直接化学发光中，氧化的底物形成激发态中间体，在衰减到基态时发出光。鲁米诺系统就是一个典型的例子[19]。

此外，间接化学发光通常涉及化学发光共振能量转移（CRET），其中能量供体将化学发光能量转移到受体。这一过程会红移发射波长，增强强度并延长发光持续时间，从而克服了波长短、强度弱和发射时间短的局限性。典型的间接CL系统包括1,2-二氧杂环烷衍生物和过氧草酸酯，广泛应用于生物医学检测。然而，化学发光探针通常半衰期较短。开发具有高量子产率和延长半衰期的新探针对于改进基于CL的成像和诊断至关重要。尽管对化学发光和生物发光探针的研究仍有限，但它们的潜力为实时监测与氧化应激相关的疾病提供了有希望的方向，值得进一步探索。

尽管广泛使用的细胞成像技术提供了丰富的细胞内信息，但它们通常仅限于成像局部区域，难以捕捉整体生理状态和动态变化。此外，大多数探针研究仍处于体外阶段，无法完全复制复杂的体内生理环境或多细胞/组织相互作用。长期体外培养可能导致原始细胞表型和功能的丧失，进一步影响研究的稳定性，并使外推到整个生物体变得困难。

体内实验可以监测疾病进展、追踪药物分布、靶向性和代谢，并反映活体动物中的复杂生理和病理过程。例如，肿瘤内的ROS波动可以作为化疗反应的生物标志物，有助于阐明药物抗性机制[8]、[9]。在临床前模型中，如NanoDCQ-3这样的探针已成功应用于糖尿病小鼠中，以可视化·OH水平，从而准确评估氧化应激潜力和药物引起的毒性[20]。对同一动物的重复成像和长期监测可以减少个体差异，便于研究疾病进展和长期药物效果。

鉴于分子探针和分子成像技术的快速发展，已经开发了大量用于检测活性物质的光学探针。然而，在复杂的体内环境中有效应用这些探针以获得可靠的生物学信息仍然是一个重大挑战。本文重点回顾了过去十年（2014–2024年）的进展，并扩展到最近关于体内模型中用于检测活性物质的光学探针的最新文献。通过根据目标分析物和染料平台的骨架对其进行分类，我们系统地回顾了它们的分子设计策略和体内成像应用。我们期望这一系统的阐述能为该领域的研究人员提供有价值的设计见解和案例研究，并促进这项技术在生命科学研究和疾病诊断中的更广泛应用。

部分摘录

ROS检测探针

ROS参与氧化应激和氧化还原信号传导，在健康和疾病中起着关键作用。在生理条件下，ROS作为防御机制——由中性粒细胞用来消灭病原体——而不会造成细胞损伤。然而，不平衡会导致ROS过量，从而氧化修饰蛋白质、脂质和DNA，进而促进炎症性疾病[21]。本节重点介绍最具生物学相关性的ROS：HOCl、H₂O₂、O₂^•-和·OH。

RNS检测探针

RNS在生理信号传导和病理应激反应中都起着重要作用。当RNS过量产生时，会引发硝基化应激，损害蛋白质、脂质和核酸，从而推动慢性疾病的发作和发展。tau蛋白和α-突触核蛋白的硝基化会加速阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等疾病的神经退行性病变[146]、[147]；RNS引起的线粒体功能障碍会加重心血管疾病，而RNS驱动的DNA突变会促进肿瘤发生

RSS检测探针

RSS在生物系统中起着关键作用，参与细胞信号传导、抗氧化、酶调节、抗炎过程和细胞保护[117]、[276]、[277]、[278]。它们的细胞内浓度需要精确调节：虽然生理水平有助于维持氧化还原平衡和防御机制，但过量积累会导致氧化损伤，并促进炎症、癌症、糖尿病以及心血管和神经系统疾病的发病机制。

基于喹啉衍生物的探针

为了推进多功能传感策略，Li等人（2019年）开发了NIR探针Mito-NIRHV（271），能够同时成像线粒体粘度和H₂O₂[340]。该探针271包含一个可旋转的乙烯基团用于粘度检测，以及一个硼酸酯结构用于H₂O₂检测。在AD模型小鼠中，尾静脉注射显示脑组织中的线粒体粘度和H₂O₂水平同时升高，说明了氧化和流变学的相互关联性

结论与展望

本文系统总结了过去十年（2014–2024年）的进展，涵盖了荧光、化学发光和生物发光探针在体内成像方面的最新文献，特别关注用于检测ROS、RNS和RSS的代表性探针。它强调了各种探针的优势和局限性，以指导检测工具的选择，并讨论了探针设计和应用的未来方向。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢国家自然科学基金（NSFC，编号82202237、22401151和82071979）、江苏省基础研究计划（BK20252073和BK20220408）以及江苏省创业团队（JSSCTD202345）的资助支持。