在鸡和青蛙的胚胎发育过程中，原肠胚形成期间的中侧神经模式形成先于背腹方向的模式形成

神经管背腹分化的早期基因表达模式及Hedgehog信号作用分析，通过鸡和爪蟾胚胎的原位杂交发现Nkx6.x和Pax基因在gastrulation阶段呈现新的中介模式表达，实验抑制激活Hedgehog通路未改变新定义的Nkx6.2和Pax7表达域，提示早期 dorsoventral 分化由未知的介侧信号调控。

Laila-Zoe Tirilomis|Stanislav Kremnyov|Natalia Petri|Christoph Viebahn|Nikoloz Tsikolia

解剖学与细胞生物学，哥廷根大学医学院，Kreuzbergring 36，37075 哥廷根，德国

摘要

引言

神经管的背腹极性基于神经发生过程中建立的分子模式，据认为这是由神经管内相反形态发生因子的精细调节所诱导的：腹侧至背侧的梯度由来自底板和脊索的Shh分泌形成，而背侧至腹侧的梯度则由来自顶板的BMP和Wnt产生。最近的研究发现，在脊索形成之前，鸡胚胎的预期底板中就已经出现了Shh的早期表达。因此，我们探讨了在鸡和非洲爪蟾中，背腹模式形成的关键组分是否也表现出“提前”的表达，以及刺猬信号通路是否参与了这种早期模式形成。

方法

通过在鸡和非洲爪蟾胚胎的晚期原肠胚期到神经发生期之间进行原位杂交，分析了关键背腹标记物的mRNA表达情况。通过使用Cyclopamine和SAG分别实验性地抑制和激活刺猬信号通路，分析了刺猬信号通路的参与情况。

结果

研究表明，在鸡胚胎的原肠胚期过程中出现了中侧模式：腹侧标记物Nkx6.1和Nkx6.2在新兴的神经板上分别表现出中线和双侧的旁中线表达，而Nkx2.2的表达也局限于中线区域，但直到神经管闭合开始时才出现。与背侧神经管和神经嵴相关的背侧标记物Pax7和Pax3在原肠胚期表现出双侧外侧表达，此外Pax3还在后部原始条纹区域表达。在非洲爪蟾中，Nkx6.2和Pax3在原肠胚期初期表现出相反的中侧模式，而Nkx6.1则从原肠胚期后期开始在中线区域表达。在激活和抑制刺猬信号通路后，新定义的中侧Nkx6.2和Pax7分布区域似乎没有变化。

结论

背腹基因表达之前，某些关键组分会先在中线区域表现出“同源”的表达模式。对鸡胚胎早期刺猬信号通路的初步功能分析表明，在原肠胚期过程中存在尚未知晓的中侧相互作用，这些相互作用导致了神经板的背腹分化。

引言

原肠胚期是所有真后生动物发育中的一个基本步骤。其特征是胚层的形成：内部的内胚层、外部的外胚层（Stern, 2004a），以及在三胚层中的中间中胚层，后者很可能起源于内胚层（Byrum和Martindale, 2004）。在脊椎动物中，胚层的形成与进一步的发育步骤在时间上重叠，包括生殖细胞的特化（Hopf等人，2011）、中胚层的细分（Harland, 2004）以及神经诱导（De Robertis和Kuroda, 2004；Stern, 2004b），这些步骤将未来的神经组织与表面的表皮外胚层分隔开来。神经诱导与中胚层的形成密切相关，这通过（1）形成两栖动物原肠孔背侧唇的轴向中胚层的组织功能（Spemann和Mangold, 1924）以及（2）羊膜动物中Hensen结或前部原始条纹的相应功能来实现（Knoetgen等人，2000；Stern, 1999；Waddington, 1950；Waddington和Schmidt, 1933）。最初将神经诱导视为原肠胚期中的一个单一的诱导或去抑制步骤的观点（Gurdon, 1987；Hemmati-Brivanlou和Melton, 1997）受到了挑战，因为发现了在非洲爪蟾胚胎中表达Chordin和Noggin的所谓原肠胚中心（Kuroda等人，2004），以及在鸡胚胎中的研究提供了关于神经诱导是一个复杂且时间上延长的事件的新的视角（Linker和Stern, 2004；Pinho等人，2011）。诱导的神经板的侧缘形成了神经板边界（NPB），该边界参与了神经嵴（Williams等人，2022）和外胚层胎盘的形成，同时也包含了表皮组织的前体以及参与背侧神经管形成的细胞（Thiery等人，2023）。在神经发生过程中，神经板的重新排列形成了神经管（Colas和Schoenwolf, 2001；Schoenwolf和Smith, 1990），其中重要的进一步步骤是神经管的背腹模式形成。根据经典观点，这种模式是由两个相反的梯度产生的（Chizhikov和Millen, 2005；Liem等人，2000；Ulloa和Marti, 2010）。在大多数模型中，腹侧至背侧的梯度由来自脊索和底板的Sonic hedgehog（Shh）分泌形成，而底板中的Shh域被认为是由脊索发出的刺猬信号诱导的（Ribes和Briscoe, 2009）。背侧至腹侧的梯度被认为是由来自神经管背部的Wnt和BMP分泌形成的（Liem等人，1995；Muroyama等人，2002）。这些梯度产生的位置信息的复杂处理被认为导致了参与神经外胚层祖细胞背腹分化的转录因子的差异性模式（Cohen等人，2014），其中背侧（pd1-6）和腹侧（p3, pMN, p2-p0）祖细胞域产生了不同类型的背侧和腹侧神经元以及运动神经元（MN）和胶质细胞。

尽管过去25年中的大量实验表明，相反的梯度在建立神经管的背腹模式中起着因果作用（Le Dreau和Marti, 2012；Zagorski等人，2017），但这些研究大多集中在神经管闭合之后的阶段。然而，我们之前的分析发现，在底板中shh的早期表达早于其在轴向中胚层中的表达，除了在前脊索板上方的区域（Kremnyov等人，2018）。此外，神经嵴祖细胞在神经板阶段就已经出现，这可能表明存在活跃的中侧信号传导，决定了神经管的背腹模式，因为这些细胞随后由于神经发生而转移到背腹方向的位置（Williams等人，2022）。这两个观察结果促使我们质疑神经管模式形成的时间维度，并提出参与神经管背腹分化的基因在神经板阶段以中侧模式表达。为了验证这一假设，我们分析了鸡胚胎中选定背侧（Pax3和Pax7）和腹侧（Nkx6.1、Nkx6.2、Nkx2.2, Olig2）基因的早期表达（参见补充图1），这些基因参与了形成祖细胞域的初始步骤（Briscoe和Ericson, 1999；Mansouri和Gruss, 1998；Sander等人，2000；Vallstedt等人，2001）。为了将鸡胚胎中的观察结果置于进化背景下，我们测试了在非洲爪蟾胚胎中这些同源基因的表达情况。作为功能分析的开始，我们使用刺猬信号通路激活剂SAG和抑制剂cyclopamine分别测试了刺猬信号通路对Nkx6.2和Pax7域限制的假设性影响；这两种物质之前已被证明在这种情况下是有效的（Negretti等人，2022；Otto等人，2014）。

部分摘要

胚胎

受精的鸡卵在潮湿条件下于38°C下孵化，直到达到所需的阶段（Hamburger和Hamilton, 1951；Pieper等人，2020）。卵壳打开后，将胚盘固定，切除，转移到培养皿中，用Locke溶液冲洗，然后在4%磷酸盐缓冲盐水（PBS）中固定1小时。为了进行体外培养，通过赤道水平的环形切割去除卵黄中的含胚盘部分

结果

为了确定背腹神经模式是否在神经管形成之前就已经开始，我们检查了在原肠胚期到神经管闭合阶段之间，对神经管背侧和腹侧祖细胞分化至关重要的选定转录因子的表达情况。

中侧神经模式

本研究揭示，在鸡和非洲爪蟾的原肠胚期初期，背腹标记基因的表达以中侧模式开始。我们的结果整合了之前未发表的数据以及其他背景下发表的基因表达模式的重评估（Bang等人，1997；Burton等人，2022；Ezin等人，2009；Khudyakov和Bronner-Fraser，2009；Paxton等人，2010；Trevers等人，2018）。

第4阶段的预期神经板

CRediT作者贡献声明

Natalia Petri：可视化、方法学、研究、数据管理。Stanislav Kremnyov：可视化、验证、监督、资源管理、数据管理、概念化。Laila-Zoe Tirilomis：可视化、研究、数据管理、概念化。Nikoloz Tsikolia：撰写初稿、可视化、验证、监督、资源管理、项目管理、研究、数据管理、概念化。Christoph Viebahn：资源管理、方法学、概念化

致谢：

我们感谢Kirsten Falk-Stietenroth、Heike Faust和Amelie Brugger提供的技术支持。SK的工作得到了Koltzov发育生物学研究所的资助（项目编号0088-2024-0012）。