冯宇晓|田恒云|惠成成|史佳琪|宋永琪|孙学素|谢洪琪|李平安|司彦波|郭涛
河南中医药大学药学院，郑州，450046，中国
摘要 Lilium brownii 是一种可用于药用和食品的植物。1-O-对香豆酰-3-O-阿魏酰甘油（CF）是从Lilium brownii 中分离得到的一种酚酸甘油二聚体。
目的 本研究旨在通过帕金森病的体内和体外模型评估CF的神经保护作用，并阐明其神经保护作用的可能分子机制。
方法 使用1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+ 建立帕金森病（PD）的体内和体外模型；通过流式细胞术检测细胞内的活性凋亡率和细胞周期分布。Western blot分析用于评估相关蛋白的表达水平。分子对接技术用于评估CF与Sequestosome 1（P62）等蛋白的结合亲和力。行为实验用于评估PD小鼠的运动能力和认知功能，并检查小鼠大脑黑质区域的神经元数量。
结果 给予CF后，PC12细胞中的凋亡率和活性氧（ROS）水平显著降低。CF显著上调了多巴胺、酪氨酸羟化酶、脑源性神经营养因子（BDNF）等蛋白的表达，同时下调了α-突触核蛋白等蛋白的表达。分子对接结果显示CF与p62等蛋白具有良好的亲和力。该化合物不仅改善了PD小鼠的运动和认知障碍，还显著增加了这些动物黑质区域的神经元数量。
结论 CF通过调节p62-Keap1-Nrf2信号通路在帕金森病中发挥神经保护作用。
引言 大量研究表明，传统中药的有效成分具有多样的药理活性，同时毒性低且副作用小。这些有利特性使它们成为药物开发的有希望的候选物质，因此发现具有高疗效和低不良反应的天然产物成为现代药物发现的关键重点。作为传统可食用药材，“白荷”是从几种Lilium 物种的鳞茎中提取的——如Lilium lancifolium Thunb.、Lilium brownii F. E. Brown var. viridulum Baker（LB）和Lilium pumilum DC——长期以来被用于饮食和治疗（Zhang等人，2022年）。Lilium brownii 可能通过调节单胺类神经递质、抗炎细胞因子IL-4的血清水平、海马区多巴胺浓度以及肠道微生物群的丰富度来缓解失眠或减轻抑郁（Gardner和Boles，2011年；Rattray等人，1996年；Si等人，2022年）。研究表明，Lilium brownii 提取物可以减轻MPTP诱导的帕金森病（PD）小鼠的氧化应激和亚铁离子（Fe2+ ）水平，促进受损神经元的恢复，并增强这些模型中的运动功能（Hui等人，2024年）。在临床实践中，Lilium 及其煎剂被广泛用于PD的管理，其疗效得到了该领域专家的认可。这些观察结果突显了Lilium 在神经系统疾病治疗中的潜力。Lilium 的化学成分包括甾体皂苷、酚类化合物、黄酮类、生物碱和多糖（He等人，2024年；Wang等人，2024b年；Zhou等人，2021年）。这些生物活性化合物具有镇静催眠、抗抑郁、抗PD、抗氧化和抗炎作用（Han等人，2018年；Yuan等人，2021年）。一篇利用网络药理学和CEO验证技术探索传统中药治疗失眠潜在机制的文章表明，Lilium brownii 中的活性成分β-谷甾醇和豆甾醇通过与关键失眠靶点的相互作用来调节昼夜节律，从而发挥治疗效果（Liu等人，2024年）。然而，Lilium成分在PD中的疗效和作用机制仍不清楚。
最近对天然植物来源化合物在PD中的研究表明，这些天然化合物可以通过恢复自噬功能来保护多巴胺（DA）神经元的完整性。这种恢复作用可以对抗α-突触核蛋白（α-syn）的聚集、毒性和类似朊病毒的传播，并促进PD引起的损伤修复（Limanaqi等人，2019年）。一项利用计算建模技术全面评估天然植物化合物对PD影响的研究发现，芦丁、去甲氧姜黄素和乙酰胆碱酯酶（AChE）分别对单胺氧化酶B（MAO-B）、儿茶酚胺氧化酶（COMT）和AChE表现出最强的抑制作用（Mazumder等人，2020年）。姜黄素是从姜黄（Curcuma longa ）的根茎中提取的多酚类化合物，以其强大的抗氧化特性而闻名。研究表明，它在PD背景下具有广泛的生物学效应和作用机制（Nebrisi，2021年）。研究发现，在药物诱导的PD动物模型中，给予姜黄素可以显著减少PD动物模型大脑中退化的浦肯野细胞和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞的数量。同时，AChE、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的水平显著增加。PD小鼠表现出的运动功能障碍得到了有效改善，伴随着胶质细胞激活和α-syn聚集的显著减少。显然，姜黄素对PD动物模型大脑皮层中的神经毒性表现有显著的缓解作用（Cui等人，2022年；Fikry等人，2022年）。近年来，从传统中药中分离出的皂苷在神经退行性疾病的治疗中显示出显著潜力。在MPTP诱导的PD小鼠模型中，人参皂苷Rb1已被证明可以有效对抗黑质-纹状体系统和皮质-纹状体系统的兴奋毒性效应。这种效应是通过上调谷氨酸转运蛋白GLT-1的表达实现的（Zhang等人，2018年）。同时，人参皂苷Rg1通过Wnt/β-连环蛋白信号通路在体内和体外PD模型中发挥神经保护作用（Zhou等人，2016年）。人参皂苷Rg1和Rb1已成为治疗PD和阿尔茨海默病（AD）的候选药物（Ding等人，2023年）。确定活性成分及其靶点是将其转化为现代疗法的关键步骤（Tu等人，2025年）。这些天然化合物通过多靶点机制表现出潜在的神经保护作用，不仅抑制氧化应激反应，还调节关键酶活性，从而减缓PD的进展。活性氧（ROS）驱动Complex I抑制、脂质过氧化和α-syn寡聚化（Costa等人，2023年；Liu等人，2022年）。越来越多的证据表明，天然抗氧化剂通过恢复线粒体膜电位和降低ROS水平来抑制α-syn聚集（Limanaqi等人，2019年；Zhang等人，2022年）。在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）模型中，Lilium brownii 提取物可以减少α-syn磷酸化并挽救黑质多巴胺能神经元（Hui等人，2024年）。进一步的研究正在探索这些化合物的体内疗效和安全性，为PD的治疗提供新的干预策略。
帕金森病（PD）是全球仅次于阿尔茨海默病（AD）的退行性神经系统疾病（Aarsland等人，2021年）。在EUROPARKINSON研究中，65-70岁人群中未诊断但筛查出的病例比例从18%增加到80-85岁人群的36%（Ben-Shlomo等人，2024年）。临床上，PD的特点是运动症状（震颤、运动迟缓、肌张力增高和步态异常）和非运动症状（睡眠障碍、嗅觉减退、情绪低落和认知障碍）（Moustafa等人，2016年；Wang等人，2023年）。其主要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元的丢失和死亡（Goedert等人，2013年；Kamath等人，2022年），以及含有错误折叠的α-syn的路易小体的形成（Leitão等人，2021年；Mahul-Mellier等人，2020年）。目前，PD的病因和机制尚不清楚，但已证实它与氧化应激、线粒体功能障碍、神经炎症以及α-syn的错误折叠和聚集有关（Ben-Shlomo等人，2024年；Chen等人，2022年）。目前的治疗方法主要是药物治疗和手术，药物治疗主要基于DA激动剂，如左旋多巴、Madopar等（Mao等人，2020年；Schneider等人，2020年）。然而，长期使用药物可能会带来一系列副作用，而手术治疗费用昂贵且难以满足大多数患者的需求（Bandopadhyay等人，2022年；di Biase等人，2023年）。因此，寻找高效且副作用少的PD预防或治疗药物具有重要的实际意义，有助于促进社会发展和人类进步。
本研究使用1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+ 建立帕金森病模型，探讨Lilium 提取物1-O-对香豆酰-3-O-阿魏酰甘油（CF）对MPP+ 诱导的PC12细胞的影响及其背后的机制。该实验的结果不仅扩展了潜在的PD治疗方法范围，还为Lilium 属植物的全面开发和应用提供了数据支持。
实验片段 细胞培养和处理 PC12细胞在含有10% FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养，温度为37°C，湿度为5% CO2 和95%空气。每1-2天更换培养液，并在细胞处于对数生长阶段时进行传代。将4×10^4/mL的细胞接种到96孔板中（每孔200 μL），并在37°C的培养箱中培养24小时。设置空白组（1640培养基）、对照组（含有细胞的1640培养基）和MPP+ 组（0.1、0.5、1、1.5和2 mmol/L）
MPP+ 诱导剂浓度的筛选 如图1所示，随着MPP+ 浓度的增加，PC12细胞的存活率显著下降，且这种下降呈剂量依赖性。在2 mmol/L时，细胞存活率显著下降，差异非常显著。因此，选择2 mmol/L的MPP+ 作为后续实验的诱导浓度。
CF对MPP+ 诱导的PC12细胞活力的影响 从图2B可以看出，CF对MPP+ 诱导的PC12细胞具有保护作用，尤其是在2 μmol/L时提高了细胞存活率。
讨论 MPP+ 是一种广泛使用的神经毒素，它通过多巴胺转运蛋白（DAT）选择性进入多巴胺能神经元并抑制线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢化物（NADH）氧化磷酸化途径。这种抑制导致细胞内氧自由基水平升高和谷胱甘肽（GSH）含量降低，最终导致多巴胺能神经元的退化和死亡（Zeng等人，2021年）。本研究中使用的PC12细胞表现出
结论与展望 CF是Lilium brownii 的单体成分，可以通过调节p62-Keap1-Nrf2通路来降低MPP+ 诱导的铁死亡和PC12细胞中的凋亡。CF可以改善MPTP诱导的帕金森病小鼠的运动功能障碍和认知能力，并恢复PD引起的黑质-纹状体区域的神经元损伤，从而发挥神经保护作用。这项研究标志着Lilium brownii 单体成分CF在帕金森病研究中的首次应用。
CRediT作者贡献声明 冯宇晓： 撰写——原始草稿。田恒云： 监督。惠成成： 数据管理。史佳琪： 方法学。宋永琪： 数据管理。孙学素： 数据管理。谢洪琪： 资源。李平安： 调查。司彦波： 软件。郭涛： 资金获取。
数据和材料的可用性 本研究中使用和/或分析的数据集可应要求从相应作者处获得。部分数据可能因伦理限制而无法提供。
资助 本研究未接受公共、商业或非营利部门的任何特定资助。
利益冲突声明 作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢 作者感谢湖南康润农业科技有限公司在本研究中的协助。
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