格尔希尔德·维尔德纳（Gerhild Wildner）| 米兰达·格赫克（Miranda Gehrke）| 奥拉夫·施特劳斯（Olaf Strauß）
来自德国慕尼黑LMU大学医院眼科（G.W., M.G.）免疫生物学部门
目的
视网膜色素上皮（RPE）构成了外层血-视网膜屏障。这一屏障将视网膜与脉络膜毛细血管以及免疫系统分隔开来。RPE通过各种受体和可溶性因子与局部和全身免疫系统进行交流，从而参与维持眼睛的免疫特权。我们最近在体内和体外实验中研究了应激状态下RPE细胞中转录因子FoxP3的表达和上调情况。FoxP3最初被认为仅存在于调节性T细胞中。基于不同FoxP3变体在RPE细胞中表达的假设，我们使用针对ARPE-19细胞中不同FoxP3表位的九种抗体来研究其亚细胞定位。
设计
我们研究了应激状态和非应激状态下ARPE-19细胞的细胞因子分泌及FoxP3表达情况。
方法
我们通过多重检测方法分析了经LPS处理或受到机械损伤的ARPE-19细胞培养上清液中的细胞因子分泌情况。随后，我们使用针对不同FoxP3结构域和磷酸化位点的免疫荧光抗体对细胞进行染色，以检测FoxP3的亚细胞定位。
主要结果指标
通过识别蛋白质上的不同表位来检测亚细胞水平的FoxP3存在情况。
结果
应激状态的ARPE-19细胞会上调炎症细胞因子（IL-6和MCP-1），这些细胞因子的表达与FoxP3在细胞质和细胞核中的定位模式（磷酸化FoxP3）相关，具体取决于所检测的表位。
结论
应激状态的RPE细胞会从耐受性表型转变为效应性表型，但它们会立即通过上调转录因子FoxP3来重新建立免疫特权，这一过程类似于免疫系统中的T细胞。这些不同的FoxP3检测模式表明，RPE在维持免疫屏障方面具有特异性作用，同时也适用于其他表达FoxP3的非T细胞组织。
引言
视网膜色素上皮（RPE）位于视网膜的外层，介于感光光感受器的外段与通过脉络膜毛细血管供应视网膜的血液之间。这种独特的定位对其功能至关重要。RPE通过参与视觉过程来维持光感受器的功能和结构完整性，同时通过形成外层血-视网膜屏障将视网膜的神经部分与全身血液循环隔开，并参与维持眼睛的免疫特权。屏障完整性的丧失或功能障碍最终会导致光感受器细胞死亡，从而引发视力丧失。免疫屏障的变化是诸如葡萄膜炎或年龄相关性黄斑变性（AMD）等视网膜疾病的核心因素。RPE依赖的免疫屏障由与其他免疫特权部位相似的组织构成，此外RPE还具有分泌免疫抑制因子（如FasL或PD-L1）的能力，以调节免疫系统的活性。当免疫细胞通过脉络膜毛细血管时，会被内皮表面蛋白激活，随后以预激活的状态进入RPE与内皮之间的空间。RPE对免疫活动的反应涉及一系列免疫调节物质，包括细胞因子和趋化因子，以及表面分子（如受体和可溶性介质）的上调，从而使免疫细胞的表型从攻击性转变为耐受性。这一过程涉及转录因子的诱导或上调，超出了单纯紧密内皮屏障的“全有或全无”功能。
最初，免疫细胞通过布鲁赫膜（Bruch’s membrane）与RPE细胞隔离，因此主要接触的是RPE分泌的因子。穿过布鲁赫膜后，免疫细胞与RPE之间的第二步相互作用是通过受体-配体结合（例如FAS/FASL、PD1/PD-L1）来抑制其活性，将其表型从攻击性转变为修复性，甚至诱导入侵细胞的凋亡。因此，由RPE形成的外层血-视网膜屏障被称为“教育性”屏障，因为免疫细胞可以轻松离开血液循环并接近上皮组织。然而，随后它们会遇到一系列免疫抑制机制，使细胞表型从攻击性转变为耐受性或修复性，从而阻止入侵细胞进一步进入视网膜。
因此，了解RPE的工作原理及其对免疫系统攻击的反应对于许多眼病的病理机制和治疗手段具有重要意义。我们发现，最初被认为是免疫系统调节性T细胞特异性标记物的转录因子FoxP3也存在于RPE中。此外，其他多种细胞和组织（包括试图逃避免疫反应的肿瘤，以及睾丸和乳腺等免疫特权器官或组织的外皮屏障）也能表达FoxP3。只有在应激状态或疾病（如葡萄膜炎或AMD）下才能观察到RPE中的FoxP3表达。我们最近在体外实验中发现了某些能够诱导或上调RPE细胞中FoxP3表达的因素，如机械性细胞损伤或促炎因子（如过敏毒素和IL-1β）。与体内的健康RPE细胞不同，培养的RPE细胞由于缺乏天然邻居而持续处于应激状态，因此会持续表达FoxP3，并可根据需要在其细胞质和细胞核之间进行转运。因此，ARPE-19细胞是研究FoxP3活性的可靠模型。
转录因子FoxP3的活性及其在基因组和蛋白质水平上的特定功能靶点受到非常复杂的调控。尽管在许多物种中都存在FoxP3的表达，但在剪接和转录后修饰方面存在物种差异，这些差异对分子的功能和精细调节至关重要。例如，FoxP3在人类和鼠类的效应T细胞中仅在细胞质中短暂表达，而在小鼠中则不表达；此外，人类和鼠类存在不同的剪接变体。FoxP3包含4个功能域，已知存在针对不同细胞类型的多种剪接变体。转录后修饰包括磷酸化和萜烯化。
我们之前在患有AMD的人类眼睛、AMD小鼠模型、实验性诱导的葡萄膜炎大鼠、激光烧伤后的大鼠RPE以及长期暴露于香烟烟雾后的小鼠RPE中观察到了FoxP3的表达。我们还观察到非融合和融合RPE培养物之间的FoxP3表达差异，这表明与邻近细胞的紧密接触对RPE的屏障功能及其细胞健康至关重要。CRISPR/Cas9敲除技术显示，FoxP3在RPE的应激反应中起着重要作用。因此，我们假设RPE中的FoxP3是一种新的重要蛋白质，它控制和支持RPE与免疫系统的相互作用以及维持眼睛的免疫特权。在本研究中，我们探讨了在不同培养条件下ARPE-19细胞系中FoxP3的诱导和亚细胞定位情况，通过LPS模拟细菌感染或Toll样受体2（TLR2）的激活来诱导细胞死亡并模拟屏障破坏，并使用针对不同FoxP3表位和磷酸化位点的抗体来识别不同应激条件下RPE细胞中FoxP3的细胞定位差异。
材料与方法
本研究为实验室研究，数据来源于体外实验。
ARPE-19细胞的细胞因子和趋化因子分泌
为了研究FoxP3的作用及其变体的存在情况，我们让ARPE-19细胞暴露于多种模拟疾病相关情况的应激条件下。我们使用LPS激活RPE细胞上的TLR2，因为已知TLR2会促进AMD中的炎症反应；刮擦细胞单层会导致细胞死亡并破坏细胞间的接触，从而模拟AMD中的伤口和屏障破坏。
讨论
我们之前已经在体内和体外实验中观察到人类、小鼠和大鼠RPE细胞中FoxP3的“异位”表达，表明该转录因子在外层血-视网膜中起重要作用。FoxP3最初被认为仅是调节性T细胞的特异性标记物，但后来发现肿瘤细胞会利用它来逃避免疫攻击，而免疫特权器官或组织的外皮屏障也会利用它来防止免疫系统的攻击。
