魏苏|陈伟琴|佘浩|宋一平|宋庆华|袁慧宗|陈林海|陈文杰|潘倩倩|彭伟
中国宁波大学附属人民医院整形外科，315040
摘要
民族药理学相关性
银杏素是一种来自银杏叶的双黄酮类化合物，以其抗炎和抗氧化特性而闻名，但其治疗骨关节炎（OA）的有效性和机制尚未得到充分了解。
研究目的
评估银杏素在氧化应激条件下的软骨保护作用，并明确PI3K/Akt信号通路相关调控Bcl-2是否介导其在OA中的抗凋亡作用。
材料与方法
使用叔丁基过氧化氢（TBHP）诱导的原代软骨细胞氧化应激模型来评估细胞活力、基质相关染色、细胞内活性氧（ROS）和氧化应激标志物以及凋亡情况。在体内实验中，通过内侧半月板不稳定（DMM）模型诱导小鼠患骨关节炎，并用不同剂量的银杏素进行关节内治疗，随后进行微CT和组织病理学评估。通过网络药理学和分子对接技术筛选潜在的作用通路，并通过免疫荧光、TUNEL、流式细胞术、Western blotting和药理学抑制实验进行验证。
结果
银杏素剂量依赖性地减轻了TBHP诱导的软骨细胞损伤，降低了细胞内氧化应激和凋亡水平，同时增加了PI3K/Akt的磷酸化水平并上调了Bcl-2的表达，同时下调了Bax的表达。在DMM小鼠中，银杏素减轻了软骨退化并改善了与OA相关的结构变化。使用LY294002抑制PI3K的药理学作用显著削弱了银杏素的抗凋亡和通路激活效果，这支持了PI3K/Akt/Bcl-2轴的因果关系。
结论
银杏素通过激活PI3K/Akt/Bcl-2轴来抑制OA的进展，从而减少氧化应激并防止软骨细胞凋亡，表明其作为OA治疗剂的潜力。
引言
骨关节炎（OA）是一种以软骨破坏、慢性滑膜炎症和异常骨重塑为特征的关节疾病（Assi等人，2023；Donell，2019；Wang等人，2020）。它是全球致残的主要原因，导致关节疼痛、僵硬和功能下降（Ilia等人，2022；Masyitah等人，2024；Tang等人，2025）。OA与衰老、肥胖和关节过度使用有关（Driban等人，2020；Goode等人，2019；Masyitah等人，2024）。在晚期阶段，OA会造成不可逆的损伤，严重影响生活质量，尤其是在缺乏有效治疗的情况下。
病理性的氧化应激被认为是驱动OA软骨退化的重要因素（Poulet和Beier，2016）。活性氧（ROS）在正常生理条件下维持细胞内信号转导的平衡中起着关键作用（Phull等人，2018）。在骨关节炎（OA）微环境中，异常的机械负荷和炎症刺激会损害线粒体功能，导致ROS的持续积累，从而引发病理性的氧化应激。过多的ROS激活应激反应通路，包括NF-κB和MAPK，这些通路会放大炎症反应并在软骨细胞中诱导分解代谢表型。这种表型的特征是关键基质降解酶（如MMP-13和ADAMTS-5）的表达上调，从而加速细胞外基质（ECM）的降解和软骨结构的恶化（Guizheng等人，2023）。同时，氧化应激与软骨细胞凋亡密切相关，因为ROS会降低线粒体膜电位并破坏Bcl-2/Bax的平衡。这种破坏会促进细胞色素c的释放和caspase级联反应的激活，触发线粒体依赖性的凋亡，进一步加剧软骨退化（Suqing等人，2023）。
银杏叶的治疗效果在多种民族药理学传统中都有记载（Liu等人，2022）。例如，《纳西医药典》中描述银杏叶具有“甜、收敛、略苦的味道和中性性质”，并提到其叶片能够“促进血液循环和缓解疼痛”（Akida和Ki Hyun，2021；Liu等人，2024；Yanmei等人，2021）。银杏叶传统上被用于缓解关节疼痛和相关不适，为其在治疗骨关节炎和其他退行性关节疾病中的潜在应用提供了民族药理学依据。银杏素是银杏叶提取物中的主要生物活性成分，因其显著的抗氧化能力而受到关注。基于此，本研究旨在阐明银杏叶提取物通过何种机制减轻骨关节炎的进展，特别关注银杏素发挥保护作用的关键信号通路。
我们使用了TBHP诱导的软骨细胞氧化应激模型，该模型在培养条件下比过氧化氢更稳定，具有更好的重复性（Pan等人，2023），并创建了内侧半月板不稳定（DMM）的小鼠骨关节炎模型（Yang等人，2021），该模型能有效模拟软骨退化，适用于研究氧化应激相关的软骨损伤。通过网络药理学分析验证了银杏素通过PI3K/Akt/Bcl-2信号通路减轻软骨退化的假设。这些发现有望为识别特定分子靶点提供实验依据，并为OA的疾病修饰疗法提供新的见解。
细胞分离与培养
从新生小鼠（≤7天大）的膝关节中分离原代软骨细胞。该实验获得了宁波大学动物护理和使用委员会（批准号：15085）的批准。小鼠被安乐死并用乙醇进行灭菌处理。然后提取软骨组织，切碎、洗涤并离心。将碎片用胶原酶II消化过夜，并用DMEM/F-12培养基终止消化。细胞悬液过滤、离心后重新悬浮在新鲜培养基中。
银杏素保护软骨细胞免受TBHP诱导的氧化应激
我们探讨了银杏素对软骨细胞的潜在细胞毒性作用（图1a）。在生理条件下进行的浓度-反应实验表明，浓度在0到20 μM范围内的银杏素对软骨细胞增殖没有显著影响（图1b）。然而，在40 μM浓度下，银杏素显著降低了细胞活力（P < 0.05）。因此，我们将药物浓度设定在1到20 μM之间，以避免毒性影响。
讨论
软骨组织中异常升高的氧化应激是OA进展中软骨细胞凋亡的主要驱动因素。在正常生理条件下，软骨细胞内的ROS处于动态平衡状态。然而，机械应力、炎症细胞因子（IL-1β和TNF-α）等因素的持续刺激会损害线粒体功能，导致ROS过度产生，同时抗氧化防御机制受损。
结论
银杏素通过激活PI3K/Akt/Bcl-2信号通路、抑制氧化应激和凋亡来缓解OA的病理变化，显示出其作为多靶点治疗剂的潜力。这些发现有助于推进基于黄酮类化合物的OA治疗策略的发展。
作者贡献声明
魏苏：撰写 – 审稿与编辑，概念构思。
陈伟琴：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，方法学设计，数据分析。
佘浩：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，方法学设计，数据分析。
宋一平：初稿撰写，方法学设计，数据分析。
宋庆华：方法学设计，数据分析。
袁慧宗：方法学设计，数据分析。
陈林海：方法学设计，数据分析。
陈文杰：方法学设计，数据分析。
伦理声明
所有实验操作均遵循动物福利原则，确保动物受到的痛苦最小化，相关方案已通过宁波大学动物护理和使用委员会（IACUC）的审查（伦理编号：15085）。
资助
本研究得到了浙江省医疗与健康项目（2025KY1341）、宁波市科学技术局项目（2022J209）和宁波市科学技术局项目（2023S041）的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
感谢所有为这项研究提供财务支持和参与的人员。
