ABSTRACT
Objective:
本研究旨在探讨选择性SYK抑制剂Sovleplenib在再生障碍性贫血(AA)中的治疗潜力，重点关注其对免疫调节以及cGAS-STING-NF-κB炎症轴的影响。
Methods:
建立免疫介导的AA小鼠模型并用Sovleplenib进行治疗。通过外周血细胞计数和骨髓单个核细胞(BMNC)计数评估造血功能。通过流式细胞术分析免疫细胞谱。通过ELISA测量细胞因子水平。通过蛋白质组学和蛋白质印迹法探索潜在机制。
Results:
Sovleplenib治疗显著改善了外周血细胞计数(HGB, WBC, PLT)和BMNCs，并减少了骨髓脂肪空泡化。它通过增加CD4+ /CD8+ T细胞比率和降低M1/M2巨噬细胞比率，促进M2表型，从而纠正了免疫失衡。同时，它提高了Arg-1水平，同时抑制了ROS、TNF-α和IFN-β。从机制上讲，Sovleplenib抑制了关键通路组分(cGAS, STING, p-TBK1, p-p65)的激活。
Discussion:
结果证明了Sovleplenib在促进造血和免疫调节方面的双重作用。其疗效在机制上与抑制过度激活的cGAS-STING-NF-κB通路有关，该通路是AA炎症的关键驱动因素。
Conclusion:
Sovleplenib代表了一种有前景的AA靶向疗法。
1. 引言
再生障碍性贫血(AA)是一种骨髓衰竭综合征，以全血细胞减少为特征，其病因和发病机制多样。细胞凋亡增加是AA全血细胞减少的主要原因。异常活化的T淋巴细胞及其过度分泌的细胞因子，特别是干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，是导致造血细胞过度凋亡的关键驱动因素。
其中，重型AA(SAA)是一种免疫介导的造血干细胞疾病，以骨髓增生低下和全血细胞减少为特征。值得注意的是，SAA进展迅速，死亡率高。当前的一线治疗包括免疫抑制疗法(IST，如抗胸腺细胞球蛋白联合环孢素)联合血小板生成素受体激动剂(TPO-RA)艾曲波帕，以及异基因造血干细胞移植(HSCT)。HSCT受限于供体可用性和移植物抗宿主病的风险。在SAA中，研究已证实将TPO-RA艾曲波帕与标准免疫抑制疗法联合使用，特别是在治疗开始时即应用并持续6个月，可显著提高疗效，并伴有骨髓CD34+细胞计数和早期造血祖细胞频率的显著恢复。TPO-RAs是一类模拟内源性血小板生成素并特异性激活其受体的小分子或肽类药物。其核心功能是刺激巨核细胞增殖和分化以增加血小板生成。这类药物的应用已从最初治疗免疫性血小板减少症扩展到成为AA治疗领域的突破性选择。然而，该方案仍有明显的局限性。尽管IST联合TPO-RAs的总体缓解率显著提高，但部分患者反应不佳或无反应，或出现复发。TPO-RAs也可能与克隆演变的风险相关，特别是出现高危细胞遗传学异常，如7号染色体缺失。这些缺点凸显出现有疗法尚未完全解决AA中免疫攻击和干细胞衰竭的根本病理相互作用。因此，开发新型靶向疗法迫在眉睫。
近年来，脾酪氨酸激酶(SYK)作为免疫受体信号转导的关键介质，因其在自身免疫性疾病中的作用而受到广泛关注。SYK抑制剂通过阻断B细胞受体(BCR)和Fc受体信号通路，抑制过度活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞，从而恢复免疫稳态。Sovleplenib是一种新型、高选择性的口服SYK抑制剂，已在中国获批用于治疗原发免疫性血小板减少症(ITP)；然而，其在AA中的疗效和作用机制尚不清楚。
先天免疫信号通路cGAS-STING在感知细胞损伤和病原体入侵中起核心作用。在AA中，骨髓中的凋亡碎片导致DNA异常积累。反过来，cGAS识别胞质DNA并催化第二信使cGAMP的合成，从而激活STING蛋白。这种激活会招募TBK1并磷酸化转录因子IRF3和NF-κB，触发I型干扰素(IFN-I)和促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6）的释放，从而放大炎症反应。cGAS-STING通路的持续激活已被证明可介导组织炎症并驱动造血干细胞耗竭。研究表明，与DNA修复相关的基因（如PICH或范可尼贫血相关基因）缺陷会导致基因组不稳定性和内源性DNA在胞质中积累，从而激活cGAS-STING信号轴。这种激活驱动了I型干扰素（如IFN-β）的过量产生。持续的干扰素信号不仅触发造血干细胞的异常增殖，还加速其凋亡并损害其长期重建能力，最终导致造血衰竭。这一机制为某些DNA修复障碍患者易患骨髓衰竭提供了分子解释。此外，它为AA的免疫病理机制提供了新的理论视角。具体而言，抑制cGAS-STING通路或其下游信号可能减轻免疫介导的造血干细胞损伤，从而为开发靶向免疫调节疗法提供潜在的理论基础。作为下游信号枢纽，NF-κB进一步放大了炎症级联反应，并在AA的免疫调节中起关键作用。
本研究旨在探讨Sovleplenib对AA小鼠模型造血恢复的影响，以及Sovleplenib是否通过调节cGAS-STING-NF-κB通路来减轻AA骨髓炎症微环境损伤。
2. 材料与方法
2.1. 实验动物
SPF级亲代雄性DBA/2和雌性C57BL/6N小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验用雌性B6D2F1/Crl小鼠（以下简称F1；8-12周龄，18-22克）是DBA/2与C57BL/6N小鼠杂交的第一代后代。雌性B6D2F1小鼠采用随机数字表法随机分为正常对照组(NC)、AA模型组(AA)或AA加Sovleplenib治疗组（以下简称Sov）（n≥6）。所有小鼠均在南通大学医学院动物中心标准条件下饲养。本研究经南通大学实验动物伦理委员会批准。
2.2. AA小鼠模型的建立
将C57/B6小鼠麻醉并安乐死。无菌采集浅表淋巴结，置于RPMI-1640培养基中，用研磨器处理制备单个核细胞悬液，然后过滤。将悬液浓度调整至(1.9–2.1)×10⁷/ml并冰上保存备用。按照建立的AA模型诱导方法，F1小鼠在4-6小时后腹腔注射0.4 ml悬液。正常小鼠作为对照组，造模小鼠随机分为AA组或Sov组并放回原饲养环境。造模当天记为第0天。从第1天开始，Sov组小鼠每天口服25 mg/kg的Sovleplenib。在第12天，收集眶静脉血、股骨骨髓单个核细胞(BMNCs)以及胸骨、股骨和脾脏组织用于苏木精-伊红(H&E)染色。未处理的F1小鼠作为额外对照。进行外周血细胞计数、BMNC计数和H&E染色病理分析以验证AA模型。
2.3. 流式细胞术
将制备好的脾脏或骨髓单个核细胞悬液（来自单只小鼠）100 μl转移至流式管中。每管用2 μl CD16/32抗体封闭，然后进行细胞表面染色。加入以下抗体（各2 μl）：CD45 (APC-Cy7), CD11b (PE-Cy7), F4/80 (APC-R700), CD86 (BV650), CD206 (AF647), CD3e (PerCP-Cy5.5), CD4 (FITC), CD8 (PE)。轻轻涡旋试管，然后在4°C避光孵育30分钟。用PBS洗涤后，用4%甲醛固定15分钟，再次洗涤，然后进行流式细胞术分析。
2.4. ELISA
使用ELISA测量小鼠外周血血浆中细胞因子(ROS, Arg-1, IFN-β, TNF-α)的蛋白水平。试剂盒购自江苏辰彤生物科技有限公司，所有操作均按照制造商说明进行。
2.5. 质谱分析
质谱工作流程包括蛋白质提取、肽段消化、色谱分离、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)数据非依赖采集(DIA)、数据库搜索以及后续的定性、定量和生物信息学分析。对原始数据进行数据库搜索后，进行生物信息学分析，包括蛋白质鉴定、差异表达分析以及功能分析，如基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。
2.6. 蛋白质印迹法
使用RIPA裂解液并补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂 cocktail 从小鼠骨髓组织中提取蛋白质。蛋白质提取物在4°C下以12,000×g离心15分钟。等量蛋白质上样到10% Tris-甘氨酸凝胶上，在120 V下电泳60分钟，然后在400 mA下转印至PVDF膜25分钟。然后将膜用含5%牛血清白蛋白或脱脂奶粉的Tris缓冲盐水和Tween(TBST)封闭，并在4°C下与一抗孵育过夜。使用的抗体包括：cGAS, STING, p-TBK1, TBK1, p-NF-κB p65, NF-κB p65, β-actin。洗涤后，膜在室温下与相应的二抗孵育1小时。然后使用红外荧光成像系统观察蛋白条带。
2.7. 数据分析
柱状图中的数据表示为至少三次独立实验的平均值±标准误(SEM)。使用单因素方差分析(ANOVA)进行比较，图像使用Origin软件处理。P<0.05认为差异具有统计学显著性。
3. 结果
3.1. Sovleplenib显著改善AA小鼠的造血功能
外周血分析显示，与NC组相比，AA组的HGB、WBC和PLT计数显著降低(P<0.001)。AA模型小鼠的血常规分析显示血小板计数(PLT)为246.5±82.4×10⁹/L，血红蛋白浓度(HGB)为53.0±9.7 g/L，白细胞计数(WBC)为0.5±0.2×10⁹/L。在Sov组中，所有三个参数均显著高于AA组(P<0.05)，其中PLT恢复接近NC水平。重要的是，AA组的BMNC计数仅为1.2±0.3×10⁶/mL，降至NC水平的5.5%，而Sov组恢复至NC水平的29%(P<0.001)。胸骨骨髓H&E染色显示NC组造血增生活跃，AA组脂肪细胞广泛浸润、造血细胞稀疏，而Sov组脂肪细胞比例显著减少，脂质空泡减少，造血岛增加。
3.2. Sovleplenib调节免疫细胞失衡
流式细胞术分析显示，Sovleplenib改善了AA模型小鼠的免疫细胞失调。与NC组相比，AA组表现出异常的T淋巴细胞亚群分布，骨髓和脾脏中的CD4+ /CD8+ T细胞比率显著降低（骨髓：0.6±0.1 vs 3.0±0.2；脾脏：0.4±0.1 vs 4.2±0.9）(P<0.001)。Sov组的该比率显著高于AA组（骨髓：1.8±0.8；脾脏：1.8±0.5, P<0.05），但仍低于NC组(P<0.05)。
同时，在AA组观察到巨噬细胞极化失衡：与NC组相比，骨髓和脾脏中的M1/M2巨噬细胞比率（M1: CD86+ ; M2: CD206+ ）显著升高（骨髓：2.8±0.6 vs 1.1±0.1；脾脏：3.0±0.5 vs 1.2±0.4）(P<0.05)。Sovleplenib治疗显著降低了该比率（骨髓：1.4±0.7；脾脏：1.8±0.1, P<0.05 vs AA），与NC组无显著差异(P>0.05)。
3.3. Sovleplenib治疗对AA小鼠Arg-1、ROS、TNF-α和IFN-β产生的影响
小鼠外周血血浆的ELISA分析表明，Sovleplenib显著改善了AA模型小鼠的造血因子水平。与AA组相比，Sov组精氨酸酶-1(Arg-1)的浓度显著增加(P<0.001)，但仍低于NC组(P<0.001)。炎症和应激标志物活性氧(ROS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-β(IFN-β)在AA组中较NC组显著升高(P<0.001)。Sovleplenib治疗显著逆转了这些变化，与AA组相比显著降低了ROS、TNF-α和IFN-β水平(P<0.001)。
3.4. 4D-DIA定量蛋白质组质谱分析
对NC、AA和Sov组骨髓样本的蛋白质组学分析鉴定出大量差异表达蛋白，组间有数百个蛋白上调和下调。聚类分析显示，与NC组和Sov组相比，AA组与坏死性凋亡相关的分子（包括Stat1, H2az2, Capn2, Casp1）以及DNA感知通路相关基因（如Gsdmd, Casp1, Samhd1, Cgas, Trex1）的表达显著增加。此外，V-ATPase质子泵的关键组分（包括Atp6v1f, Atp6v0d1, Tcirg1）在AA组中也表现出表达改变。火山图进一步突出了AA组和Sov组之间的差异基因表达。生物过程GO富集分析显示，差异表达蛋白显著参与免疫、先天免疫和细胞焦亡。KEGG通路分析将这些蛋白与NOD样受体信号通路和EB病毒感染联系起来，这些通路与cGAS-STING信号传导密切相关。
3.5. Sovleplenib抑制AA骨髓中cGAS-STING-NF-κB通路的过度激活
蛋白质印迹分析表明cGAS-STING信号轴被激活。与NC组相比，AA小鼠骨髓中cGAS、STING和下游分子p-TBK1的表达水平显著升高(P<0.01)。Sovleplenib治疗显著抑制了这些蛋白的表达。NF-κB通路在AA组中持续激活，p65的磷酸化(p-p65)在AA组中显著增加(P<0.001)，表明NF-κB转录活性增强。Sovleplenib治疗显著降低了p-p65水平，证明其对NF-κB激活的抑制作用。
4. 讨论
本研究首次在AA动物模型中证明，SYK抑制剂Sovleplenib通过靶向并抑制cGAS-STING-NF-κB炎症轴，有效缓解骨髓衰竭并促进造血恢复。
重型AA(SAA)以自身免疫性T细胞介导的造血干细胞损伤和骨髓脂肪增多为特征。本研究中，Sovleplenib治疗显著改善了外周血三系细胞计数，并显著增加了骨髓有核细胞数量，表明造血干细胞/祖细胞的存活和增殖得到增强。相应的血液学参数改善、脂肪空泡减少以及H&E染色骨髓中造血细胞增加，共同证明Sovleplenib可有效逆转AA的骨髓衰竭并恢复造血功能。
流式细胞术进一步表明，Sovleplenib治疗可提高CD4+ /CD8+ T细胞比率并降低M1/M2巨噬细胞比率，表明该抑制剂可通过抑制过度活跃的细胞免疫反应和促进巨噬细胞向促修复表型极化来恢复AA中失衡的免疫微环境。此外，研究发现Sovleplenib可抑制骨髓中活化T细胞的扩增，显著降低促炎性M1/M2巨噬细胞比率，并促进巨噬细胞向M2表型极化。此外，ELISA分析显示血浆Arg-1水平显著升高，表明其具有双重调节作用：抑制效应免疫的同时增强免疫耐受，从而有助于恢复免疫平衡。
为了探究潜在的分子机制，研究人员进行了蛋白质组学筛选，重点关注cGAS-STING-NF-κB信号通路。AA组中坏死性凋亡相关分子表达升高表明骨髓细胞处于严重的病理应激状态。这导致溶解性细胞死亡，将细胞内含物（如DNA）释放到细胞外空间，从而强烈激活免疫系统并招募炎症细胞至损伤部位。这反过来又上调了DNA感知通路相关基因，触发了强烈的先天免疫反应和炎症。关键的下游炎症基因，包括Icam1, Nfkb2, Rigi，也升高了，表明cGAS-STING等DNA感知机制可能在AA病理免疫微环境的建立中起关键作用。V-ATPase质子泵相关基因的表达改变提供了进一步的支持，因为该复合物上的SYK激活可启动由DNA传感器cGAS介导的先天免疫信号。
蛋白质印迹分析证实了AA骨髓中cGAS-STING通路的异常激活，表现为cGAS、STING以及下游蛋白p-TBK1和p-p65 (NF-κB)的磷酸化显著增加。通常，cGAS-STING通路感知胞质DNA并介导先天免疫反应，其持续激活导致过量的I型干扰素（如IFN-β）产生和慢性炎症，这与在AA模型中的观察结果一致。本研究中，Sovleplenib治疗有效抑制了这些关键信号分子的激活，表明其核心药理作用涉及靶向并抑制cGAS-STING-NF-κB通路的过度激活。通过阻断异常的cGAS-STING信号传导，Sovleplenib可显著减少NF-κB驱动的炎症细胞因子产生。这些发现表明，在AA中，免疫介导的攻击诱导造血细胞大量凋亡，释放出可被cGAS检测的胞质DNA。这激活了STING和TBK1，通过NF-κB触发炎症细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）的爆发，并创造了“炎症-细胞死亡”的恶性循环。
本研究证明SYK抑制剂Sovleplenib可通过抑制cGAS-STING-NF-κB炎症信号通路的过度激活，有效缓解AA模型小鼠的造血衰竭。总之，研究结果为AA提供了一种新的靶向治疗策略，并为探索SYK抑制剂与现有疗法（如环孢素或TPO-RA）的联合治疗提供了理论依据。鉴于SYK抑制剂和环孢素作用于不同的免疫通路，未来的研究有必要在动物模型中探索Sovleplenib与环孢素的联合使用。这将评估这种组合是否能产生协同效应，可能允许减少每种药物的剂量，同时最小化单药治疗的潜在副作用。这可为后续的临床联合试验提供重要的临床前理论依据。然而，未来的临床试验需要验证其在AA患者中的疗效和安全性，并进一步阐明SYK介导的免疫调节的分子机制及其与先天免疫通路的相互作用。
总的来说，本研究系统地阐明了Sovleplenib通过促进造血恢复和恢复免疫微环境平衡来治疗获得性AA的双重机制。重要的是，研究揭示了cGAS-STING-NF-κB通路的过度激活驱动了AA的发病机制，而Sovleplenib通过靶向该通路发挥其治疗作用。
伦理批准
所有动物程序均遵循ARRIVE指南，并得到南通大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准（伦理批准号：S20231015-004）。
数据可用性声明
研究中使用的数据集可向通讯作者合理索取。
打赏
