从中国奶牛场分离出的牛支原体菌株：基因组特征、抗菌耐药性及与毒力相关的结构差异分析

中国2018-2023年11省47株牛支原体（M. bovis）全基因组测序显示，以ST-52谱系为主（87.5%），存在vsp家族及粘附-免疫调节区域（Mbov_0723–0735）缺失，PZJS01株诱导凋亡达28%，耐药性强于红霉素（97.9%）、泰洛星（59.6%），对氧四环素完全耐药，但对多西环素和泰拉霉素敏感，揭示其克隆扩散、毒力进化及耐药风险，为防控策略和疫苗设计提供依据。

吴春林|孙学强|吴玉伦|舒杰|史志宇|龚凤菊|姚火春|潘志豪

中国南京农业大学兽医学院OIE猪链球菌参考实验室

摘要

牛支原体（M. bovis）是一种新出现的主要牛病原体，在全球乳制品和牛肉产业中造成了经济损失。本研究对2018年至2023年间从中国11个省份收集的47个代表性分离株进行了全基因组测序，并将数据与86个全球参考基因组进行了比较。核心SNP系统发育分析和核心基因组多位点序列分型（cgMLST）显示，中国分离株主要属于I型谱系，ST-52型占主导地位（87.5%），具有高度的遗传同源性和地理聚集性。毒力因子的注释鉴定出六类功能基因，而中国分离株在vsp家族和黏附-免疫调节区域（Mbov_0723–Mbov_0735）内表现出不同程度的缺失。使用代表性菌株PZJS01（完整）、PZNX02（部分未检测到）和PZHLJ02（大片段未检测到）进行的功能验证表明，携带完整致病岛的PZJS01表现出更强的侵袭性，并显著诱导宿主细胞凋亡（约28%）。这些发现表明，该结构区域可能在致病过程中起关键作用。抗菌药物敏感性测试显示，中国分离株普遍对红霉素（97.9%）和泰乐菌素（59.6%）具有抗性，所有菌株对土霉素均不敏感，显示出多重耐药性。相比之下，多西环素和替米考星在体外测试中表现出良好的活性。本研究系统地阐明了M. bovis在中国的克隆传播模式、毒力进化及抗菌药物耐药性风险，为制定控制策略和疫苗设计提供了科学依据。

引言

牛支原体（M. bovis是一种新出现的主要牛病原体，在全球乳制品和牛肉产业中造成了经济损失[Maunsell et al., 2011, Ball et al., 2010]。目前尚无针对该病原体的有效疫苗，且其对β-内酰胺类抗生素具有天然抗性[Calcuttet et al., 2018]。此外，其对多种蛋白质合成抑制剂的抗性持续上升，对畜牧业生产构成了严重威胁。

解析病原微生物的遗传结构和进化关系是揭示其致病机制和适应策略的基础。随着高通量测序技术的普及，高分辨率工具如核心基因组单核苷酸多态性（core-SNP）分析和核心基因组多位点序列分型（cgMLST）已被广泛用于多种临床分离的支原体物种的群体结构研究（包括鸡支原体[Ghanem et al., 2019]、滑膜支原体[Ghanem et al., 2018]和生殖支原体[Fookes et al., 2017]），这些方法均表现出良好的分型能力。先前的研究表明，M. bovis分离株的流行率和多样性反映了其遗传特征[Kumar et al., 2020, Breton et al., 2012]。然而，关于中国流行M. bovis菌株的系统基因组数据仍然有限，限制了对其遗传多样性的理解。因此，基于高分辨率的核心基因组分型策略对于深入理解中国流行M. bovis菌株的进化谱系和群体特征至关重要。

牛支原体的致病性由多种促进免疫逃逸、黏附和持续感染的毒力因子驱动[Perez-Casal. 2020]。尽管其基因组较小（约1 Mbp），M. bovis在某些区域表现出显著变异，如可变膜表面脂蛋白（vsp）基因、多种黏附素和代谢相关应激激酶等[Behrens et al., 1994, Sachse et al., 2000, Ledger et al., 2020]。其中，丰富的Vsps具有高度免疫原性并频繁发生相位变异，被认为是M. bovis实现长期定植和免疫逃逸的核心机制[Behrens et al., 1994, Sachse et al., 2000]。此外，与vsp基因簇相邻的Mbov_0722–Mbov_0735区域是一个高度可变的基因组片段，在不同菌株间表现出多样的缺失和重排模式[Ambroset et al., 2022]。这些结构变异可能重塑黏附特性和表面抗原谱型，尽管它们与致病表型的确切关系仍有待进一步阐明。

牛支原体的抗性不断增加令人担忧。由于其对细胞壁靶向抗生素具有天然抗性，临床治疗主要依赖于蛋白质合成抑制剂，如大环内酯类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类[Sulyok et al., 2014, Klein et al., 2019]。然而，近年来这些抗生素的抗性持续上升，多重耐药菌株频繁出现，进一步加剧了治疗的难度。因此，建立标准化的最低抑菌浓度（MIC）检测系统和区域抗性数据平台对于规范用药和优化治疗策略至关重要。

本研究分析了2018年至2023年间来自中国11个省份的47个M. bovis分离株，并与86个全球参考基因组进行了系统比较基因组学和功能验证研究，以揭示中国分离株的遗传多样性和致病潜力。具体目标如下：（i）在全球背景下描述中国分离株的系统发育关系和群体结构；（ii）探讨关键毒力相关基因组区域的结构变异及其与黏附和侵袭等表型的关联；（iii）评估分离株对主要抗菌药物的敏感性和耐药性。

样本收集、基因组测序和注释

2018年至2023年间，本研究从中国11个省份的23个奶牛场收集了287份具有呼吸道或乳腺炎症状的临床样本。所有样本均保存在4°C下，并在24小时内进行处理。提取核酸后，使用青岛利健生物技术有限公司生产的专用实时PCR试剂盒（No.TP5125）进行病原体检测。阳性样本被接种到PPLO琼脂培养基中以进行分离。

中国牛支原体分离株的系统发育和群体结构特征

为了研究中国分离株的遗传多样性和其在全球背景下的系统发育特征，对研究中获得的47个代表性牛支原体分离株进行了全基因组测序。使用QUAST评估了基因组组装质量，所有基因组的完整性良好。中国分离株的基因组大小介于0.83至0.96 Mb之间，GC含量为29.32%–30.03%（补充表S1）。此外，还检索了86个高质量的参考基因组。

讨论

本研究分析了2018年至2023年间从中国11个省份临床病例中收集的47个牛支原体分离株以及86个国际参考菌株。通过整合系统发育和群体结构分析、抗菌药物敏感性测试以及毒力相关结构变异和功能表型的评估，系统地描述了在中国奶牛群中流行的牛支原体的基因组特征和流行病学风险。

首先，

结论

基于2018年至2023年来自中国11个省份的47个牛支原体分离株和86个参考基因组的研究结果，发现在中国奶牛群中流行的牛支原体群体主要由以ST-52为中心的克隆谱系主导，群体内的遗传多样性有限，并已发展出多重耐药性，主要涉及大环内酯类、某些四环素类和氟喹诺酮类抗生素。在Vsp家族中发现了多种缺失/突变模式。

伦理批准

本研究遵循南京农业大学（中国南京）的伦理指南和标准生物安全及机构安全程序进行。由于未涉及动物实验，因此无需伦理批准。

作者贡献

• C.
  W. 设计并监督了这项研究。Y.W. 和 J.S. 培养并表征了牛支原体分离株。X.S. 和 Z.S. 提供了试剂/材料/分析工具。F.G. 分析数据。H.Y. 和 Z.P. 进行了正式分析并获得了资金支持。C.W. 起草并撰写了手稿。所有作者均阅读并批准了最终稿件。

未引用参考文献

(Ball and Nicholas, 2010, Calcutt et al., 2018, Ghanem and El-Gazzar, 2019, Ghanem and El-Gazzar, 2018, Parker et al., 2016, Murai and Higuchi, 2019, Lysnyansky and Ayling, 2016, Zerbino and Birney, 2008)

CRediT作者贡献声明

孙学强：软件、方法学。吴春林：写作——初稿、方法学、数据管理。潘志豪：写作——审稿与编辑、资金获取、概念构思。史志宇：软件、资源。舒杰：软件、方法学、调查。姚火春：写作——审稿与编辑、资金获取。龚凤菊：项目管理、正式分析。吴玉伦：资源、方法学、数据管理。

利益冲突声明

本研究得到了江苏省产学研合作项目（项目编号HMSY21001）的支持。作者声明这些利益并未影响本文研究结果的客观性或有效性。所有作者均确认与本文不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了江苏省产学研合作项目（项目编号HMSY21001）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

数据可用性

本研究使用的全基因组测序数据可在Science Data Bank公开获取（DOI: 10.57760/sciencedb.31423）。