聚焦超声联合微泡增强抗CTLA-4抗体脑内递送及免疫微环境调控研究

本综述系统阐述了聚焦超声（FUS）联合微泡（MBs）技术如何非侵入性、可逆地开放血脑屏障（BBB），显著提升抗CTLA-4抗体在脑胶质瘤靶区的递送效率。研究通过对比长脉冲与快速短脉冲（RaSP）序列，证实RaSP可实现更均匀的药物分布（p=0.0130），并首次揭示长脉冲序列能显著激活肿瘤微环境中CD3+T细胞（p=0.0021）和MHC II+抗原呈递细胞（p=0.0001），为克服胶质瘤异质性及免疫治疗耐药提供了创新策略。

Abstract

胶质瘤，特别是胶质母细胞瘤，具有预后差和患者生存率低的特点。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抗体（CTLA-4）作为一种免疫检查点抑制剂（ICI），在胶质瘤微环境中对抗最具侵袭性的肿瘤细胞方面显示出潜力。然而，血脑屏障（BBB）阻碍了其向大脑的递送，该屏障存在异质性渗漏，导致药物在肿瘤内分布不均。聚焦超声（FUS）联合静脉注射微泡（MBs）是一种能够非侵入性、安全、可逆地增加靶向区域血脑屏障通透性的技术，可促进免疫检查点抑制剂等治疗药物递送至难以到达的肿瘤区域，从而有助于预防肿瘤复发。

研究方法中，在给予荧光标记的抗CTLA-4抗体之前，研究人员将两种不同类型的聚焦超声序列（长脉冲与快速短脉冲（RaSP））与微泡联合应用于野生型雌性C57BL/6小鼠的左海马区。结果显示，两种脉冲序列的超声处理后，靶向脑区的抗体递送均显著增加。当使用快速短脉冲序列（脉冲串由短至5 µs的脉冲以1.25 kHz的快速重复频率发射）进行处理时，实现了更均匀的递送（p值 = 0.0130）。在长脉冲处理的大脑中还观察到抗肿瘤免疫细胞显著增加（CD3⁺细胞p值 = 0.0021，MHC II类⁺细胞p值 = 0.0001）。结论认为，这些结果为聚焦超声联合微泡如何促进均匀的抗肿瘤药物递送并调节免疫微环境提供了原理验证。

Introduction

胶质瘤是成人中枢神经系统（CNS）中最常见的恶性肿瘤，其中胶质母细胞瘤是最具侵袭性的类型。当前的治疗方法包括手术切除肿瘤、化疗和放疗。尽管有这些治疗策略，胶质瘤，特别是胶质母细胞瘤的预后仍然很差，诊断后的中位生存期约为12-18个月。有效治疗策略的主要障碍在于肿瘤异质性，因为胶质母细胞瘤由对不同治疗反应不同的胶质瘤干细胞亚型组成。因此，需要一种能够解决胶质瘤细胞组成异质性的治疗策略，即需要一种全局靶向肿瘤微环境不同元素的策略，包括肿瘤细胞、免疫细胞、细胞因子和内皮细胞。

免疫检查点阻断剂是一种新兴的治疗策略，旨在阻断免疫检查点的促肿瘤作用。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）是其中一种免疫检查点，当其未被抗CTLA-4抗体（免疫检查点抑制剂）阻断时，会与抗原呈递细胞（APCs）上的受体结合，促进T细胞失活。研究表明，抗CTLA-4治疗在富含间充质样胶质瘤干细胞（最侵袭性的胶质瘤干细胞亚型）的胶质瘤小鼠模型中，可将生存期延长2至3倍。这种免疫抑制方法对胶质瘤生存至关重要，因为CD4⁺和CD8⁺T细胞通常通过分泌促炎细胞因子（如干扰素-γ（IFN-γ））来招募更多T细胞，在肿瘤微环境中发挥关键的抗肿瘤作用。这些T细胞的激活依赖于它们与APCs（包括树突状细胞、B细胞和小胶质细胞）的相互作用。因此，免疫检查点阻断剂是一种有前景的治疗策略，因为它们可以抵消胶质瘤关键的促肿瘤机制，例如免疫检查点的过度表达，以促进T细胞激活。然而，这些抗体向大脑的递送受到血脑屏障（BBB）不通透性的阻碍。

血脑屏障负责维持中枢神经系统的稳态并保护其免受毒素和病原体侵害。这是由于毛细血管壁内皮细胞之间存在连接蛋白，这些细胞还含有外排泵，使得大脑对大多数大分子药物不通透。然而，在肿瘤中，血脑屏障以异质性方式渗漏，通常被称为血瘤屏障（BTB）。这意味着肿瘤内需要靶向以产生有效抗肿瘤反应的区域将经历不同程度的药物递送，这反过来可能促进肿瘤复发。

聚焦超声（FUS）联合微泡（MBs）是一种由Hynynen等人于2001年首次描述的技术，可以安全、可逆、靶向地增加血脑屏障的通透性。该技术将超声波聚焦到大脑内的靶向区域，同时将微泡注入血流。这些微泡作为超声造影剂已获临床批准，通常由蛋白质或脂质外壳包裹气体核心组成，直径在1-10 μm之间。当这些微泡进入超声波靶向区域时，它们会膨胀和收缩，对血管壁产生机械应力，从而增加血脑屏障的通透性。该技术此前已用于递送免疫检查点阻断剂程序性死亡配体1（PD-L1）和程序性死亡蛋白1（PD-1）穿过血脑屏障。这两项研究均显示，以长10 ms脉冲序列发射的FUS增加了这些抗体向大脑的递送。据研究者所知，目前尚无研究显示FUS和MBs可以增加抗CTLA-4抗体向大脑的递送。本研究旨在探讨FUS和MBs是否能增加抗CTLA-4免疫检查点阻断剂向大脑的递送，以及快速短脉冲（RaSP）序列是否可用于此目的。RaSP序列由以快速重复频率发射的短微秒脉冲串组成，已被证明能促进多种药物的更均匀递送，具有更高的安全性和更快的血脑屏障闭合速度。换句话说，RaSP有潜力实现抗CTLA-4抗体更均匀、广泛的递送，使其能够到达血瘤屏障仍然完好的更多位置。改善递送均匀性可以减轻其他方法（例如通过全身注射更多药物来增加局部药物浓度）确保药物递送的压力，研究表明全身注射伊匹木单抗（商业抗CTLA-4抗体）后，局部药物浓度（C_min）与免疫相关不良事件增加相关。

研究使用健康野生型雌性C57BL/6小鼠作为这些抗体穿过屏障的最不通透条件模型，因为它们具有完整的血脑屏障。研究人员在静脉注射微泡和荧光团标记的抗CTLA-4抗体时，使用长脉冲或RaSP超声序列靶向小鼠大脑的左海马区。提取大脑后，进行冰冻切片和成像，以量化靶向海马区与对照脑区（未接受超声处理）检测到的荧光量，从而确定长脉冲与RaSP超声处理如何影响递送。随后，研究探讨了这些处理是否调节了靶向脑区的免疫微环境。针对这第二个目标，他们对处理过的小鼠切片进行了CD3⁺和主要组织相容性复合体II类⁺（MHC class II⁺）细胞染色。CD3⁺被用作T细胞的常见标志物，T细胞在抗肿瘤免疫中起关键作用，并且是抗CTLA-4抗体的靶点。对MHC class II⁺细胞进行染色是因为它们是CD4⁺T细胞亚群的抗原呈递细胞，后者触发细胞毒性CD8⁺T细胞反应并促进形成长期抗肿瘤反应所需的记忆CD8⁺T细胞池。

Materials and Methods

Animals

实验使用野生型雌性C57BL/6小鼠（N=6），年龄在8-12周之间（体重19.82 ± 2.23克）。所有小鼠在实验前至少适应环境7天，饲养在温度20–24°C、湿度45–64%、12小时昼夜周期的独立通风笼中。实验均获得帝国理工学院动物福利与伦理审查委员会及英国内政部监管机构批准，并遵循英国1986年《动物（科学程序）法案》进行。

Ultrasound Setup and Experimental Workflow

小鼠使用1.5–2.0%挥发性异氟烷与氧气（1 L/min）混合麻醉。剃除头顶毛发后，将小鼠固定于立体定位仪上。在头顶涂抹凝胶后放置具有石蜡膜底的水浴装置。通过将水浴中的1毫米厚十字线与小鼠头骨的矢状缝和人字缝对齐进行靶向定位。左海马区被靶向，右海马区作为对照。使用中心频率1 MHz、焦距60.5 mm、直径90 mm的单元件球面聚焦超声换能器。对于长脉冲超声处理，使用一个函数发生器发射脉冲重复频率为0.5 Hz的10,000周期脉冲序列。对于RaSP序列，使用两个函数发生器分别控制脉冲形状和脉冲序列，发射由5周期脉冲组成的序列，脉冲重复频率为1.25 kHz，分组为10 ms的脉冲串，脉冲串重复频率为0.5 Hz。两种序列均使用减压峰值负压0.71 MPa，总共发射126个脉冲。选择此压力是为了确保抗体外渗到大脑中，因为先前工作表明0.35 MPa不足以让内源性免疫球蛋白穿过血脑屏障。报告的压力是经过减压计算的，考虑了通过小鼠顶骨11.2 ± 0.29%的衰减。

发射5个对照超声脉冲后，静脉注射SonoVue®微泡（浓度：5 μL/g体重）。随后立即通过尾静脉注射5 μg PE/Cyanine7标记的抗CD152（抗CTLA-4）抗体。超声处理结束后，立即腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，并进行经心脏灌注冰PBS和10%福尔马林。取出大脑并在10%福尔马林中固定24小时，然后在溶于dH₂O的30%蔗糖中冷冻保存直至切片。

Sectioning

大脑在OCT中包埋，使用异戊烷和干冰浴。然后使用冷冻切片机切取30 µm厚的水平脑切片，载物台温度为-16°C，刀片温度为-18°C。将切片转移到载玻片上，并在两天内使用显微镜成像。

Immunofluorescence Staining Workflow

使用大鼠抗小鼠CD3一抗和Alexa Fluor 488标记的山羊抗大鼠IgG H&L二抗对T细胞进行染色。使用抗大鼠MHC class II（I-A/I-E）纯化一抗和相应的Alexa Fluor 488标记二抗对MHC class II⁺细胞进行染色。染色流程包括空气干燥、使用柠檬酸盐缓冲液在80°C进行抗原修复（MHC class II⁺细胞1分钟，CD3⁺细胞10分钟）、通透、封闭、一抗4°C过夜孵育、二抗室温孵育2小时，最后使用含DAPI的封片剂封片。

Imaging

所有成像均在显微镜上完成，使用10倍物镜。分别使用特定激发和发射滤光片检测PE/Cyanine7、DAPI和Alexa Fluor 488荧光信号。

Image Analysis

为了比较长脉冲和RaSP序列之间的递送差异，使用标准化光密度（NOD）测量。首先通过MATLAB使用直方图转移方法对图像进行归一化。计算NOD时，从处理和对照感兴趣区域（ROI）的单个像素强度中减去对照ROI的平均像素强度，然后对成功递送的强度（设定为对照ROI平均强度两倍标准差以上）进行求和。每个生物重复的NOD通过计算810 µm脑厚度内各切片NOD的平均值确定。为了确定递送分布，通过计算每个生物重复在810 µm脑厚度内靶向ROI像素强度的标准差与平均值的平均比率来计算变异系数（COV）。使用CellProfiler设计的自动化流程量化靶向ROI与对照ROI中的免疫细胞数量，该流程应用于270 µm脑厚度的30 µm切片。用于计算NOD、COV和免疫细胞计数的原始数据是在对超声序列类型（长脉冲或RaSP）设盲的情况下生成的。

Statistical Analysis

对NOD数据（长脉冲 vs RaSP）进行双尾非配对t检验（Welch校正），置信水平95%。对COV数据（长脉冲 vs RaSP）进行双尾非配对t检验，置信水平95%。对于CD3⁺和MHC class II⁺细胞计数分析，使用非配对多重t检验（Welch校正），并采用错误发现率方法进行多重比较校正。所有p值小于0.05被认为具有统计学显著性。使用四分位距（IQR）方法确定异常值。

Results

RaSP Ultrasound Promotes a Homogeneous Delivery of Anti-CTLA-4 Antibodies to the Brain

FUS处理左海马区后，观察到无论使用何种超声参数，靶向脑区检测到的荧光均比对照区域增加，表明荧光标记的抗CTLA-4抗体成功递送。通过计算NOD量化两种超声序列之间的成功递送差异，结果显示在0.71 MPa超声压力下，长脉冲和RaSP处理小鼠之间的NOD无显著差异（p值 = 0.1095），表明两种序列递送的抗CTLA-4抗体量无显著差异。然而，长脉冲处理大脑的NOD范围（122,683）和标准误（± 35,668）均大于RaSP处理大脑（范围13,293，标准误± 3,879）。使用COV计算确定两种参数下递送的异质性，发现RaSP处理大脑的COV（0.0037 ± 0.00093）显著低于（p值 = 0.0130）长脉冲处理大脑（0.0134 ± 0.0021），表明RaSP递送均匀性更高。

Ultrasound with Microbubbles Also Modulates the Immune Microenvironment

通过免疫荧光染色检测T细胞和MHC class II⁺细胞的存在，以确定超声处理后免疫微环境的变化。观察到抗CTLA-4抗体与CD3⁺T细胞共定位，以及抗CTLA-4抗体与MHC class II⁺细胞邻近，与使用的超声序列无关。研究发现，在长脉冲处理的大脑中，与对照区域相比，靶向脑区检测到的CD3⁺和MHC class II⁺免疫细胞数量更多。在RaSP处理的大脑中也观察到处理脑区与对照脑区两种免疫细胞数量的差异，但检测到的细胞数量少于长脉冲处理。定量分析显示，在长脉冲处理的小鼠中，超声处理脑区的CD3⁺细胞（p值 = 0.0021）和MHC class II⁺细胞（p值 = 0.0001）总数与对照相比显著增加。而在RaSP处理组中，这种增加未达到统计学显著性。

Discussion

无论应用何种超声脉冲序列，在健康野生型小鼠的超声处理脑区均观察到抗CTLA-4抗体递送增加，这与预期一致，因为血脑屏障通常仅对分子量小于400-600 Da的亲脂性药物通透，而作为IgG亚型抗体的抗CTLA-4抗体分子量约为150 kDa。

研究证明了FUS和MBs能够增加血脑屏障通透性，足以让抗CTLA-4抗体进入大脑。接着比较了长脉冲和RaSP超声序列处理后抗体递送的差异以及免疫微环境的变化。长脉冲和RaSP处理后检测到的抗体递送量无显著差异，但RaSP处理的小鼠表现出更低的COV。COV是平均荧光强度离散度的度量，该值在RaSP处理大脑中较低，表明个体强度变异较小，提示抗体分布更均匀。这可以用RaSP序列的特性解释，该序列由以高重复频率发射的短脉冲组成，旨在允许更持续的微泡活动，并使微泡在脉冲间沿血管移动，促进屏障更均匀的开放。相比之下，长脉冲序列的特点是脉冲较长，被认为会对血管的特定位置产生应力。这些观察结果进一步得到以下事实的支持：长脉冲处理的三个小鼠的NOD之间存在较大的范围和标准误，表明长脉冲处理后递送存在较大的变异性。然而，考虑到样本量小以及生物样本固有的变异性，不宜过度解读此观察结果。

在免疫微环境方面，仅在长脉冲处理的大脑中发现CD3⁺T细胞和MHC class II⁺细胞数量显著增加。然而，在所有处理过的小鼠中，无论使用何种序列，都观察到抗CTLA-4抗体与这些免疫细胞共定位的实例。这种共定位是预期的，因为CTLA-4和CD3蛋白都存在于T细胞表面，CD3蛋白是T细胞受体复合物的一部分。MHC class II⁺细胞负责向T细胞亚群呈递抗原，这会使它们与抗CTLA-4抗体近距离接触。

仅在长脉冲处理的大脑中发现免疫细胞数量显著增加，并且两种免疫细胞在处理脑区和对照脑区之间的荧光差异在长脉冲处理后比RaSP处理更为明显。定量分析证实了这种效应。这可以解释为，超声处理后，长脉冲处理的小鼠比RaSP处理的小鼠观察到更高水平的血脑屏障渗漏。这很可能是由于长脉冲超声导致血管通透性在某些区域增加得更多，而RaSP序列则产生更均匀的开放。这种增加的外渗可能促进更多T细胞以及APCs向靶向脑区募集。在发生脑出血的患者中观察到这种现象，这些免疫细胞会趋向于血管渗漏或微出血区域。因此，既然长脉冲导致更多外渗，那么在这些大脑中观察到更多T细胞和MHC class II⁺细胞也就不足为奇了。

预计这种趋势会长期维持，因为长脉冲序列增加血脑屏障通透性的时间更长（介于4-48小时），而RaSP序列在低声学压力（1 MHz下0.35 MPa）下仅能促进血脑屏障通透性改变短至10-20分钟。这意味着长脉冲处理后，免疫细胞有更多时间浸润大脑。未来的工作应在胶质瘤模型中探索这些模式，以确定FUS处理后浸润/驻留免疫细胞在肿瘤微环境中的具体作用和贡献。

这些结果表明，使用FUS和MBs增加血脑屏障通透性可显著提高抗CTLA-4抗体递送。虽然与长脉冲处理的小鼠相比，使用RaSP超声序列治疗能促进抗体更均匀的递送（考虑到BTB的异质性，这将是一个优势），但在此声学压力下，只有长脉冲治疗影响了免疫微环境。未来的工作需要微调这两种序列的参数，以找到既能促进抗体均匀递送又能刺激关键抗肿瘤免疫细胞浸润的“最佳点”。例如，增加发射RaSP序列时的声学压力，因为这将促进血脑屏障更大程度的开放，从而导致更多外渗，正如在使用RaSP向大脑递送脂质体或内源性免疫球蛋白时所观察到的那样。增加RaSP序列中的脉冲长度也可用作进一步增加血脑屏障通透性的方法。此外，未来的研究应考虑使用标准化的声学剂量来比较这些脉冲序列。考虑到本研究的样本量小和选择的动物模型，本文作为一项探索性研究，为FUS联合MBs，特别是RaSP序列在改善胶质瘤免疫检查点递送方面的潜在治疗应用提供了原理验证。未来的工作需要测试这些观察结果，特别是免疫微环境的变化，是否在更大的小鼠队列和胶质瘤小鼠模型中仍然成立。

Conclusion

研究证明了如何通过利用不同的FUS序列与MBs结合，不仅可以在最不通透的血脑屏障小鼠模型中实现免疫检查点抑制剂递送的增加，还可以调节免疫微环境。这为这种治疗方法确保药物递送至血瘤屏障最不通透区域，从而降低肿瘤复发风险，提高胶质瘤患者成功治疗可能性的潜力提供了原理验证。