袁晨|光月|刘彦军|王伟|姜戈|张金华|卓嘎|张彦飞|刘晓雅|任庆佳|李超龙
中国药科大学理学院化学系，南京，211198，中华人民共和国。
摘要
背景
慢性萎缩性胃炎（CAG）是Correa级联反应中的一个关键癌前阶段，其特征是胃腺体逐渐且大部分不可逆地丧失，以及胃癌风险增加。仁清昌觉（RQCJ）是一种经典的藏药复方，已在胃炎治疗中显示出临床和药理效益，但其对CAG的作用机制尚未得到充分阐明。
目的
本研究旨在明确RQCJ在CAG中的治疗疗效及其作用机制。
方法
我们建立了一种网络药理学-生物信息学工作流程，以预测RQCJ在CAG中的潜在靶点。通过整合TCMSP/SwissTargetPrediction获得的靶点与CAG相关基因，构建了STRING蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并进行了GO/KEGG富集分析。采用UHPLC–HRMS/MS技术对成分进行了表征。建立了MNNG诱导的CAG小鼠模型（对照组、模型组、伟福春阳性对照组、RQCJ低剂量组和高剂量组），并通过组织病理学（H&E）、免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）、TUNEL、ELISA和Western blot（WB）进行了验证。在体外实验中，使用CCK-8、划痕伤口愈合实验和Annexin V–FITC/PI流式细胞术评估了MNNG损伤的GES-1细胞。在机制研究中，采用了RT-qPCR、WB和基于参考的转录组测序技术，并通过AutoDock Vina对接评估了化合物的成药性。
结果
RQCJ显著改善了体内和体外的MNNG诱导的慢性萎缩性胃炎。UHPLC–HRMS/MS分析鉴定出43种成分，其中31种被检测为循环原型。网络药理学首次预测了154个潜在的RQCJ–CAG靶点，这些靶点在TNF/NF-κB信号通路中富集；将血清吸收的成分靶点与CAG相关基因结合后，精炼出140个高置信度的靶点，这些靶点在TNF/NF-κB通路中具有显著的富集效应。功能研究表明，RQCJ（20–40 μg/mL）可提高GES-1细胞的存活率和迁移能力，同时抑制细胞凋亡；在小鼠体内，RQCJ还能剂量依赖性地修复胃黏膜结构，降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，并使胃泌素和胃蛋白酶原恢复正常。此外，RQCJ还降低了两种模型中的IL-8、CCL2和CXCL1的mRNA水平，同时增加了IL-10的水平。在机制层面，RQCJ以剂量和时间依赖的方式抑制了IKKβ、IκBα和NF-κB p65的磷酸化，减少了切割的caspase-8/3，并恢复了Bax/Bcl-2的比例。转录组学证实了NF-κB和凋亡通路的富集，与140个血清基靶点差异表达的基因交叉分析得到了99个核心基因，这些基因均与TNF/NF-κB介导的凋亡相关。分子对接进一步支持了靶点的结合，其中一种chromen-7-ol衍生物显示出对MMP9的强亲和力。
结论
综合这些多层次的数据表明，RQCJ通过多组分抑制TNF–NF-κB/Caspase-3通路、广泛调节促炎/抗炎细胞因子以及恢复胃功能，从而对CAG具有临床保护作用。
引言
慢性萎缩性胃炎（CAG）的特点是胃腺体逐渐且大部分不可逆地丧失，是Correa级联反应中的一个关键癌前阶段（Kuang等人，2024；Yang等人，2025）。其自然病程通常从慢性炎症发展为腺体萎缩、肠化生和异型增生，显著增加了胃癌的风险（Bi等人，2025；Pellegrino和Gravina，2025）。其主要原因是幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染，CAG还与自身免疫机制以及不良生活方式因素（如饮食习惯、吸烟和饮酒）有关（Zheng等人，2023）。治疗的目标是减缓病情进展、预防恶性肿瘤并缓解症状：根除幽门螺杆菌是一线治疗手段，但难以逆转已形成的萎缩或肠化生（Yamada等人，2018）；对症治疗包括使用抑酸剂、黏膜保护剂、维生素B12、促动力药物和消化酶补充剂（Kuang等人，2024）。中度至重度萎缩的患者，尤其是伴有肠化生或异型增生的患者，应接受标准化的内镜监测和定期活检，高级病变可能通过内镜切除术治疗（Shen等人，2025）。鉴于当前“抑制为主”的治疗理念以及缺乏能够逆转组织萎缩的药物，强调整体、多靶点干预的传统医学体系需要经过严格的方法学评估，以确定其促进黏膜修复和逆转萎缩变化的潜力（Ren等人，2025）。
TNF信号通路促进炎症并驱动腺体萎缩，使病变向胃癌的癌前阶段发展（Jiang等人，2021；Tang等人，2025；Zhou等人，2022a）。当TNF与TNFR1结合时，会形成Complex I（TRADD/TRAF2/cIAP1/2, RIPK1）；K63连接的泛素化激活IKK，导致IκB降解和NF-κB核转位，从而诱导炎症和促生存基因的表达（Jiang等人，2021；Lousa等人，2022）。当信号通路切换到Complex II（TRADD/FADD/caspase-8）时，会触发细胞凋亡（Xue等人，2017）；如果抑制caspase-8并激活RIPK1/3，则会引发MLKL介导的坏死（Gao等人，2025；Lousa等人，2022）。
仁清昌觉（RQCJ）是一种经典的藏药方剂，被誉为“藏药之王”。它包含一百多种稀有药材（如珍珠、朱砂、沉香、诃子、牛黄、麝香和藏红花）（Zhu等人，2025）。根据藏医理论，RQCJ具有清热解毒、调和身体、平衡三大基本原则的作用（Wang等人，2020；Zhang等人，2021）。传统上，它被用于治疗“木布”病、各种中毒性疾病和慢性发热性疾病（Xu等人，2018）。现代研究表明，RQCJ具有多种作用机制，包括抗炎、抗氧化、黏膜修复、免疫调节和改善微循环等作用，特别是在治疗慢性胃炎方面具有显著潜力（Li等人，2024）。因此，本研究将采用现代方法系统评估RQCJ治疗CAG的疗效和机制。
藏医的特点是多组分、多靶点和多途径的作用，传统方法难以系统地阐明这些机制（Wang等人，2025；Zhang等人，2024）。网络药理学构建了化合物-靶点-疾病网络，揭示了方剂的分子基础（Chintaluri等人，2025；Huang等人，2025）；分子对接模拟了活性成分与关键蛋白质之间的结合构象和亲和力，为潜在的治疗靶点提供了结构依据（Berenger等人，2021；Paggi等人，2024）；转录组学在基因组范围内绘制了药物诱导的差异表达基因和通路扰动（Lowe等人，2017；McGettigan，2013）。将这些方法结合起来，可以系统地解析RQCJ的作用机制，并为后续的体外和体内验证提供方向和证据。
本研究系统阐明了RQCJ的抗CAG机制。首先，基于网络药理学，我们将构建化合物-靶点-疾病网络，确定TNF轴及其下游的NF-κB和凋亡通路作为连接炎症和上皮损伤的核心枢纽。然后通过分子对接和转录组学验证这些预测，并在体内和体外模型中进行机制验证，以评估其抗炎效果、促进黏膜修复和调节细胞命运的作用。这种“从预测到验证”的工作流程旨在为多组分藏药方剂在CAG治疗中的应用提供证据、转化途径和候选生物标志物。
RQCJ提取物的制备
RQCJ被研磨成细粉并精确称重。按每100毫克粉末加入5毫升40%乙醇-水溶液（v/v）的比例进行混合。混合物在60°C的水浴中回流提取两次，每次2小时。提取后，以6000 r/min的速度离心10分钟，收集上清液。让上清液静置直至乙醇完全蒸发。所得溶液通过0.22 μm滤膜过滤。
基于UHPLC–HRMS/MS的RQCJ鉴定和血清药理学分析
使用UHPLC–HRMS/MS在正离子和负离子模式下系统地分析了仁清昌觉提取物的化学成分。通过将准确的分子量（m/z）和MS/MS碎片模式与数据库和文献参考进行比较，共鉴定出43种化合物（图1和表S1、S2）。随后的血清药理学分析确认其中31种成分存在于循环系统中，其中20种被标记为原型化合物。
讨论
慢性萎缩性胃炎（CAG）是一种常见的消化系统难治性疾病，其特征是胃腺体逐渐且大部分不可逆地丧失，常伴有肠化生和异型增生（Zhang等人，2025）。在Correa级联反应中，它是一个关键的癌前阶段（Yao等人，2025）。持续的幽门螺杆菌感染是最常见的原因；其他因素还包括对胃黏膜细胞的自身免疫损伤（导致……）
结论
本研究结合了网络药理学和转录组学来预测关键靶点和通路，并通过体内/体外实验和分子对接进行了多层次验证，以阐明仁清昌觉（RQCJ）治疗CAG的机制。结果表明，RQCJ主要抑制TNF/NF-κB/Caspase-3通路，显著下调TNF-α、IL-1β和IL-6的水平；减少p-IKKβ/p-IκBα/p-NF-κB的激活；抑制PI3K/AKT/ERK通路的磷酸化。
CRediT作者贡献声明
袁晨和光月：撰写原始草稿、进行研究、数据管理、进行正式分析。刘彦军和王伟：参与动物实验和Western blot分析。姜戈、张金华和卓嘎：负责方法学设计和研究。张彦飞：负责监督。刘晓雅：负责监督。任庆佳和李超龙：负责监督、项目管理和资金申请。所有数据均为内部生成，未使用任何第三方数据生成工具。所有作者同意对研究的各个方面负责。
作者贡献声明
袁晨：撰写原始草稿、进行研究、进行正式分析、数据管理、概念构思。
光月：撰写原始草稿、进行研究、进行正式分析、数据管理、概念构思。
刘彦军：负责方法学设计。王伟：负责方法学设计。姜戈：负责方法学设计。张金华：负责方法学设计。卓嘎：负责方法学设计。张彦飞：负责方法学设计。刘晓雅：负责监督。任庆佳：负责监督。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了西藏自治区科学技术计划（XZ202301YD0018C）、西藏自治区重点研发计划（XZ202301ZY0015G）、国家自然科学基金（82474189）、江苏省前沿技术研发计划（BF2024054）、国家自然科学基金青年基金（82404580）、江苏省自然科学基金（BK20231021）以及澳门青年学者计划的支持。
