Abstract
一种新型的白藜芦醇和芦丁双重负载递送系统（RES-RU-micelles）被成功开发并进行了系统表征。分析内容包括粒径参数（平均粒径和多分散指数）和表面电荷，测试在制备后24小时以及在两种不同温度（4°C和25°C）下储存2个月后进行。计算机ADME预测揭示了白藜芦醇（Log Kp = -5.47 cm/s）和芦丁（Log Kp = -10.26 cm/s）之间显著的皮肤渗透性差异。分子分析表明，RES（Log P = 2.57, TPSA = 60.69 Å2 ）和RU（Log P = -2.11, TPSA = 269.43 Å2 ）相反的理化性质使其能够在胶束内实现空间分离。RES主要通过疏水相互作用定位于疏水核心，而RU则通过与亲水组分的氢键作用位于核-壳界面。双重负载中两种生物活性物质的包封效率均达到98%以上。粘弹性分析显示，在测试频率范围内，储能模量（G‘）高于损耗模量（G“），表明所开发的胶束更具弹性而非粘性。DSC分析未显示任何峰，证实了生物活性物质负载入胶束后未发生结晶。TEM分析确认了所制备胶束的形态和形状。
1. Introduction
皮肤疾病的治疗涉及多种药物和产品，例如紫外线防护剂、抗氧化剂、抗炎药、抗生素、保湿剂、愈合剂和镇痛药，这些药物可以外用或内服。然而，这些常规疗法通常不足以治疗皮肤伤口的炎症和增生。作为一种替代和/或补充方法，植物和水果是药理活性成分（如类黄酮和多酚化合物）的天然来源，具有多种有益特性，可增强皮肤完整性和健康。
多酚化合物作为新型药妆品和皮肤营养制剂正变得越来越受欢迎，因为它们在多种生物系统中具有有益作用。它们是一类基于植物的功能性膳食成分，具有多样的化学结构和一系列生物活性，包括抗氧化、抗炎和抗癌作用。然而，许多多酚化合物由于水溶性差，在药物产品中的应用有限。
白藜芦醇（RES）是一种多酚类非黄酮化合物，也是一种天然的植物抗毒素，由植物在病原体攻击时产生，可见于葡萄（皮和籽）、坚果、浆果和红酒中。RES被发现可激活II相药物代谢酶，抑制环氧化酶和氢过氧化物酶活性，具有抗炎特性，并通过促进早幼粒细胞白血病细胞分化显示抗增殖作用。RES还可以减轻癌细胞的多药耐药性，当与经批准的化疗药物联合使用时，RES可以作为有效的抗癌药物，与经典抗肿瘤药物产生协同效应并改善其药代动力学特征。RES具有多种有益特性，包括抗炎和免疫调节活性，促进伤口愈合和血管生成。由于其胶原刺激和抗氧化特性，它也用于化妆品中作为光保护剂和抗衰老剂。近年来，RES因其对多种微生物的广谱抗菌活性以及成功治疗各种皮肤疾病（如伤口、痤疮和黑色素瘤）而被广泛研究。
尽管RES口服吸收相对较好，但它会经过首过肝消除过程，导致口服生物利用度低，此外，其半衰期非常短，约为8到14分钟。因此，对于皮肤损伤的治疗，RES的局部给药被认为是比口服途径更合适的替代方案，因为RES在皮肤中的代谢显著低于肝脏，因此，可以有更多的活性物质递送到目标部位。此外，与口服治疗相比，局部RES治疗的副作用风险较低，并且潜在的皮肤刺激性据报道也较低。然而，由于RES的疏水性以及控制其在皮肤中命运的挑战，局部治疗仍然是一个难题。
芦丁（RU），或称维生素P，也是一种广泛存在于多种植物中的多酚类黄酮化合物，具有大量的生物学特性。如先前报道，RU的水溶性和稳定性有限，导致生物利用度降低。它通常口服作为补充剂，据报道可以预防神经炎症，促进神经嵴细胞存活，并具有抗抑郁、镇痛和抗伤害作用。
为了扩大RES和RU在药物制剂中的应用，纳米技术是一种值得考虑的方法，旨在提高药物的物理化学稳定性和溶解度。RES和RU的低溶解度和低化学稳定性是可以通过负载到脂质纳米粒中来克服的限制，因为后者可以提供更高的化学稳定性、控制释放，并可以作为皮肤渗透和肠道吸收增强剂。
多种脂质纳米粒已被开发，例如自（微）乳化药物递送系统、纳米乳剂、纳米结构脂质载体、固体脂质纳米粒和脂质胶束。胶束被认为是表面活性剂分子在液相中分散的聚集体或超分子结构，平均直径范围在5到100纳米之间。脂质核心胶束是由具有两个不同亲水性区域分子（磷脂）形成的正常相胶束，其中一个亲水区域朝向外部，另一个疏水区域朝向核心内部。这些分子被称为两亲分子，使得胶束能够携带亲脂性和亲水性化合物。
本工作描述了用于RES的创新脂质胶束的开发，并测试了相同的系统用于RES和RU双重负载的理化稳定性、包封参数、计算机ADME预测和流变学特性。胶束是通过组合两种不同的表面活性剂获得的，即低亲水亲油平衡值（HLB ≈ 3-4）的大豆卵磷脂和高HLB值（≈ 15）的聚山梨酯80，以确保获得用于溶解多酚化合物的脂质核心，分散在水相中。两种表面活性剂均为公认安全（GRAS）状态。据我们所知，这是关于在同一胶束中双重负载RES和RU的首次报道。
2. Materials and Methods
2.1. Materials
研究中使用的材料包括聚山梨酯80（Acofarma, Barcelona, Spain）、L-α-磷脂酰胆碱（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）、白藜芦醇（RES）（Fagron, Barcelona, Spain）、芦丁（RU）（Acros Organics, Geel, Belgium）。所有实验均使用自供去离子水（Milli-Q water, Merck Millipore, Burlington, MA, USA）。
2.2. Production of micelles
采用热剪切均质技术，随后进行超声处理法制备水性胶束分散体。制备了负载白藜芦醇（RES）的胶束样品、负载芦丁（RU）和RES的胶束样品以及空白胶束（不含任何生物活性成分）样品。简要地说，将含有聚山梨酯80溶解于水中的水相加入到含有酚类化合物的由大豆卵磷脂组成的脂质相中，两者在恒定搅拌下加热至混合物沸腾。之后，混合物在高速搅拌器（IKA T25, Staufen, Germany）中以7000 rpm的速度高速搅拌5分钟，然后在振幅70%的条件下超声处理5分钟（(Sonics Vibracell, Newtown, CT, USA) using Qsonica 4435 Q55 Sonicator Microprobe, 1/4′′, with 0.635 cm of tip diameter）。所得分散体储存在两个不同温度（4°C和25°C）下，以备后续使用。对于空白胶束，在脂质相与水相混合之前不添加多酚。所开发胶束的组成如表1所示。分散体被监测和表征了60天。
2.3. Average size, polydispersity index and zeta potential
通过动态光散射（DLS）方法测定空白和负载胶束的平均粒径（Z-Ave）和粒径分布（多分散指数，PDI）。使用Zetasizer PRO（Malvern Instruments, Malvern, UK）进行分析。分析前，样品用超纯水（1:10）稀释。使用同一设备，在将样品用电导率调节至50 µS的水稀释后，通过测量胶束的电泳迁移率来记录Zeta电位（ZP）。所有样品在25°C下进行分析，数据以平均值±标准偏差表示。
2.4. Transmission electron microscopy
使用透射电子显微镜（TEM）（Zeiss EM900, Florida, USA）分析所开发胶束的形态和尺寸。设备在80 kV下进行分析。分析时，将20 µL样品滴在覆盖有碳膜的300目铜网上2分钟。用滤纸吸去多余溶液，然后将铜网空气干燥。随后，样品用乙酸双氧铀溶液（2% w/v）进行负染色。
2.5. In silico pharmacokinetics
通过计算机分析评估药物的药代动力学特征。分子结构在SwissADME平台上构建并提交，这是一个广泛用于预测药代动力学行为和类药性的工具。
2.6. Differential Scanning Calorimetry
使用DSC 200 F3 Maia ®设备（NETZSCH, Selb, Germany）对开发的胶束样品进行差示扫描量热法（DSC）分析。将约5 mg每种样品称重放入铝坩埚中，随后密封，置于位置1。在位置0放置一个空坩埚作为参比。块状RES和块状RU（药物粉末）从10°C加热至290°C（高于其熔点10-20°C）。两者的加热速率均为每分钟10°C。样品池用氮气吹扫（流速30 ml/min）。胶束在相同条件下进行测试，但最高温度设为70°C。结果生成热谱图，并使用Proteus® 6.1.0B热分析软件（NETZSCH, Selb, Germany）分析焓值数据、起始温度和熔点。
2.7. Encapsulation efficiency and loading capacity
通过离心分离未包封的药物后，测定含有白藜芦醇胶束的包封效率（EE）和载药量（LC）。将样品置于超滤装置（10KDa Amicon; Merk Millipore®, Carrigtwohill, Ireland）中，在3500 rpm下离心30分钟。然后，取1 mL清澈上清液，用1 mL甲醇稀释，并根据校准曲线（RES: y = 0.1422x - 0.0524, r² = 0.9991；RU: y = 0.1843x + 0.1154, r² = 0.9981）进行定量，以确定RES（在306 nm测量）和RU（在355 nm测量）的浓度。然后根据以下公式计算EE和LC：EE (%) = [M(T) - M(f)] / M(T) × 100；LC (%) = [M(T) - M(f)] / M(lipid) × 100，其中M(T)是胶束中白藜芦醇或芦丁的总量，M(f)是胶束分散体中游离白藜芦醇或芦丁的量，M(lipid)是胶束中脂质的总量。
2.8. Rheological analysis
使用Kinexus Lab+流变仪（Malvern, Worcestershire, UK）对开发的胶束进行流变学分析，该仪器配备20 mm板直径的探头。用于分析的测试是在恒定应力振幅1 Pa下进行的振荡频率扫描测试。使用的频率范围为0至10 Hz。样品在25°C下测量，设备平板和探头之间的间隙为1 mm。将一小部分样品放在设备平板上并施加剪切应力。分析后，使用rSpace for Kinexus Lab+软件（version 1.75 Malvern Instruments）收集数据。
2.9. Statistical analysis
所有结果均以平均值±标准偏差（SD）表示。通过双因素方差分析（two-way ANOVA）分析样品平均粒径、PDI和ZP获得的数据，并使用Tukey多重比较检验（Tukey's multiple comparisons test）比较组间差异，显著性水平设定为p值 < 0.05。使用GraphPad Prism 8.4.3进行统计分析。
3. Results and Discussion
所有负载胶束均使用4.9%（w/w）的大豆卵磷脂和0.1%（w/w）的活性化合物作为系统的脂质相进行生产。水相由94%（w/w）的水和1%（w/w）的表面活性剂（聚山梨酯80）组成。对于空白胶束，组成相同，但不含生物活性物质。图3显示了所开发胶束的照片，显示生产一天后外观均匀。
为了评估制剂的稳定性并确定粒径分布的窄度，分析了Z-Ave和PDI。在所有开发的制剂生产后第1天、第7天、第15天、第30天、第45天和第60天测定Z-Ave、PDI和ZP。生产后24小时（第1天）获得的结果显示，在25°C储存的空白胶束的平均粒径为64.34 ± 0.23 nm，PDI为0.272 ± 0.004；在4°C储存的空白胶束的平均粒径为65.37 ± 0.41 nm，PDI为0.278 ± 0.002。负载多酚的胶束显示出比未负载胶束更大的粒径值。RES负载胶束在25°C储存时的Z-Ave为70.87 ± 1.05 nm，PDI为0.267 ± 0.004；在4°C储存时的Z-Ave为69.47 ± 0.66 nm，PDI为0.273 ± 0.006。RES-RU负载胶束在25°C储存时的平均粒径为68.78 ± 0.41 nm，PDI为0.2737 ± 0.008；在4°C储存时的平均粒径为70.41 ± 1.16 nm，PDI为0.276 ± 0.004。由于两个样品都呈现出低PDI，因此认为制剂是单分散的。
图4显示了在两个不同储存温度下，平均粒径参数和ZP值随时间的变化。与空白胶束相比，RES负载胶束和白藜芦醇-芦丁负载胶束的Z-Ave值在两种储存温度下的几乎所有时间段都显著增加。然而，在25°C储存60天后（图4A）以及在4°C储存15天和30天后（图4B），含有两种生物活性物质的胶束的Z-Ave与仅含RES的胶束相比显著增加。
根据PDI数据，在25°C下，RES负载胶束获得的值在两个月内与空白胶束相比显著增加（图4C）。当将含有RES的胶束与在25°C储存的双重负载胶束进行比较时，也发生了同样的情况。
高ZP值，例如|± 30 mV|，被认为能够为胶体分散体提供增强的物理化学稳定性，因为排斥力倾向于防止颗粒聚集。在我们的工作中，获得的结果在描述为该参数最佳值的范围内，即在空白样品和负载生物活性物质的胶束中，记录了负值，范围在-41.96至-64.18 mV，这是长期静电稳定的脂质纳米粒的典型特征。总的来说，在两个月内，ZP值保持在可接受值的范围内，被认为是制剂稳定性的良好指标。
注意到储存在不同温度的两种胶束制剂之间的ZP值存在显著差异。对于在25°C储存且含有RES的胶束，ZP值变化较大，并且总体上，与空白胶束相比，生产后第30天起ZP（模量）显著降低（图4E）。对于含有RES和RU的胶束，从生产后第7天到第45天也出现了相同的模式。然而，储存60天后获得的双重负载胶束的ZP值与仅含RES的胶束相比显著增加（图4E）。对于在4°C储存的负载胶束，ZP保持显著较高（图4F），证实了所开发胶束的高静电稳定性。因此，样品的储存温度是胶束稳定性的决定因素。
使用TEM分析来获取所开发胶束的形态和形状信息。TEM图像显示球形胶束，直径低于100 nm（图5）。TEM技术记录的胶束尺寸略小于DLS技术记录的值。
使用SwissADME工具进行计算机ADME预测，以评估白藜芦醇和芦丁的药物适用性和分子特征（表2）。
白藜芦醇（C14 H12 O3 , MW = 228.24 g/mol）呈现相对较小的分子结构，具有中等亲脂性（Log P = 2.57）和低拓扑极性表面积（TPSA = 60.69 Å2 ），与其作为亲脂性分子的分类一致。该化合物表现出高胃肠道（GI）吸收和血脑屏障（BBB）渗透性，水溶性为5.16 × 10-4 mol/L，分类为难溶性。白藜芦醇符合Lipinski五规则（Rule of Five），生物利用度评分为0.55，表明尽管溶解度有限，但具有良好的口服类药性。
与此形成鲜明对比的是，芦丁（C27 H30 O16 , MW = 610.52 g/mol）显示出 substantially 更大的分子结构，具有两亲性特征，反映在其负Log P值（-2.11）和极高的TPSA（269.43 Å2 ）上。芦丁糖二糖的存在赋予了亲水性特性，导致低GI吸收、无BBB渗透性，并被分类为P-糖蛋白（P-gp）底物。芦丁违反了Lipinski五规则（MW > 500, 氢键受体数 > 10, 氢键供体数 > 5），并表现出较低的生物利用度评分（0.17），凸显了需要递送系统来增强其药物性能的关键需求。
这些对比鲜明的物理化学特征为理解这些多酚在胶束结构内的差异定位提供了分子基础。本研究中形成的混合胶束表现出在68-71 nm范围内的流体动力学直径（图4），提供了足够的空间容量以容纳两个多酚分子在不同的区域。考虑到白藜芦醇和芦丁的分子尺寸相对于胶束直径相对较小，多个多酚分子可以共存而不会产生显著的空间位阻。聚山梨酯80/磷脂酰胆碱混合胶束系统已被广泛报道作为疏水和两亲生物活性化合物的有效载体，因为它们能够提供疏水核心和亲水壳环境。
白藜芦醇和芦丁截然不同的物理化学性质，特别是它们相反的亲脂性（Log P: 2.57 vs. -2.11）和TPSA值（60.69 vs. 269.43 Å2 ），强烈支持它们在胶束结构内的不同优先位置，这实际上通过最小化对同一空间区域的竞争而有利于共包封。
白藜芦醇的亲脂性（Log P = 2.57）、平面结构、高BBB渗透性和相对较低的TPSA表明其对疏水环境有强亲和力。白藜芦醇主要定位于胶束的疏水核心，主要通过疏水和范德华力与聚山梨酯80的脂肪酸链（油酸部分）和磷脂酰胆碱的烃链相互作用。研究一致表明，白藜芦醇通过这些非共价相互作用被物理包封在疏水胶束核心内。此外，白藜芦醇的芳香环可以与聚山梨酯80油酸链中存在的不饱和键建立π-π堆积相互作用。高皮肤渗透系数（Log Kp = -5.47 cm/s）和对CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4酶的抑制特征表明，包封也可能提供代谢保护。
芦丁的两亲性特征，反映在其负Log P（-2.11）、极高的TPSA（269.43 Å2 ）和大分子量（610.52 g/mol）上，决定了其在核-壳界面区域的优先定位。大量的氢键供体（10个）和受体（16个）使其能够与亲水胶束组分广泛相互作用。光谱研究已经证实了芦丁在胶束框架界面的定位，其槲皮素苷元部分（更疏水）渗透到疏水区域，而芦丁糖二糖（高度亲水，导致高TPSA）保持朝向水相。这种空间分布允许芦丁与聚山梨酯80的聚氧乙烯链和磷脂酰胆碱的磷酸胆碱头基形成多个氢键。芦丁的P-gp底物性质及其低BBB渗透性进一步支持了其优先定位于水界面而非疏水域深处。
在混合胶束中加入磷脂酰胆碱，通过与疏水嵌段的紧密疏水相互作用提供了增强的热力学稳定性，同时为多酚羟基基团的相互作用在磷酸胆碱头基提供了额外的氢键位点。磷脂酰胆碱的这种双重功能有助于在单个胶束结构内容纳疏水性（白藜芦醇，Log P = 2.57）和两亲性（芦丁，Log P = -2.11）多酚。
多酚的共包封不仅在结构上可行，而且可能具有协同作用，这得到了计算预测和实验证据的支持。
白藜芦醇和芦丁之间Log P值（ΔLog P = 4.68单位） 和 T P S A
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