布鲁氏菌感染的巨噬细胞衍生的微粒可增强宿主对布鲁氏菌的获得性免疫反应

微颗粒介导布鲁氏菌感染中巨噬细胞与树突状细胞互作，通过激活NF-κB通路增强IL-12/TNF-α分泌，驱动Th1极化免疫应答并激活CTL特异性杀伤，为疫苗开发提供新策略。

张玉婷|袁静|吴傲迪|王泽轩|倪荣荣|闫凯欣|梁晓阳|何涛|顾茂源|孟创|李红环|张长锁|盛金良|马中晨|徐明国|张彦兵|Zhumanov Kairat Toksanbaevich|张俊波|易继海|王月丽

中国新疆石河子市石河子大学动物科学技术学院，邮编832003

摘要

微粒（MPs）通过转运生物活性分子在细胞间通讯中发挥关键作用，具有重要的临床诊断和下一代疫苗开发潜力。布鲁氏菌是一种导致严重人畜共患病的细胞内病原体，它通过持续感染来逃避宿主免疫；然而，布鲁氏菌诱导的微粒在调节适应性免疫中的作用仍不明确。在本研究中，我们发现用减毒的布鲁氏菌 melitensis M5菌株感染RAW264.7巨噬细胞会触发大量微粒的释放。这些微粒通过促进细菌清除和限制细菌在细胞内的存活来增强宿主防御。在小鼠模型中，微粒能够引发强烈的Th1极化免疫反应，表现为IgG2a水平升高和IFN-γ产生增加。从机制上讲，M5感染巨噬细胞产生的微粒激活了骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）中的核因子-κB（NF-κB）通路，从而增加了IL-12和TNF-α的分泌。重要的是，微粒通过直接和间接途径激活细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），导致布鲁氏菌感染细胞的特异性裂解。总体而言，布鲁氏菌诱导的微粒作为整合的免疫原单位，连接了先天免疫识别和适应性效应反应，揭示了新的宿主-病原体相互作用机制，并推动了基于微粒的布鲁氏菌病防治策略的发展。

引言

布鲁氏菌病是一种由布鲁氏菌引起的重大人畜共患病，其特征是发热、慢性关节炎和生殖障碍（Khurana等人，2021年）。该疾病在全球范围内每年导致超过50万新病例，对公共卫生构成严重威胁，并给畜牧业带来重大经济损失（Guihot等人，2004年；Qureshi等人，2023年）。传播通常通过与受感染动物的直接接触或食用受污染的动物产品发生。如果不及时治疗，布鲁氏菌可引起慢性感染并导致多系统并发症（Shakir，2021年）。

在感染过程中，布鲁氏菌能够逃避免疫清除并在宿主细胞内持续存在（Barrionuevo和Giambartolomei，2019年）。虽然先天免疫反应（包括巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬作用）可以部分控制细菌的扩散，但彻底清除依赖于T淋巴细胞介导的适应性免疫，这通过抑制树突状细胞（DC）的成熟、下调促炎细胞因子（白细胞介素-12、IL-12；肿瘤坏死因子-α）以及减少抗原呈递分子（MHC I、MHC II）的表达来实现（Chang等人，2015年；Skendros和Boura，2013年）。这些机制使得布鲁氏菌能够逃避免疫并引发慢性感染。

微粒（MPs）被定义为直径在120-1000纳米之间的细胞外囊泡（EVs），在细胞应激或感染期间直接从质膜释放，越来越多地被认为是宿主-病原体相互作用中的关键介质（Najdaghi等人，2024年；Rother等人，2022年）。与较小的外泌体（30-120纳米）不同，后者来源于内体途径，由感染细胞内病原体（如结核分枝杆菌、单核细胞增生李斯特菌）释放的微粒通过三种主要机制调节免疫反应：（1）向T淋巴细胞呈递MHC抗原；（2）传递免疫调节物质（包括干扰素刺激基因产物ISG15、IFIT1-3）和促炎细胞因子；（3）招募先天免疫细胞以增强炎症反应（Hare等人，2015a）。与微粒相关的干扰素诱导效应物（如IFITM3）具有双重功能，既能增强溶酶体酸化以清除细胞内病原体，又能增强抗病毒防御（Zhang等人，2020年）。这一发现揭示了先天免疫对抗多种病原体的新机制。

在本研究中，我们探讨了微粒与布鲁氏菌感染模型中的各种免疫细胞和途径之间的相互作用。我们的目标是确定微粒是通过直接还是间接途径诱导T淋巴细胞的增殖和活化，从而启动效应T淋巴细胞来消除目标细胞中的布鲁氏菌。此外，我们还揭示了微粒介导宿主对布鲁氏菌获得性免疫的分子机制。

细胞、布鲁氏菌菌株和小鼠

RAW264.7小鼠巨噬细胞系来自中国科学院细胞库（中国上海）。布鲁氏菌 melitensis疫苗菌株M5由中国疾病预防控制中心（北京）提供。六周大的雌性BALB/c小鼠来自新疆医科大学。所有动物实验均获得了机构动物伦理委员会的批准（批准号A2024-441），并遵循NIH动物实验指南进行。

微粒的形态学特征

通过透射电子显微镜和纳米粒子追踪分析发现，微粒呈囊泡状结构（图1A），直径在120–1000纳米之间（图1B）。

微粒中布鲁氏菌的初步鉴定

为了检测微粒中是否存在布鲁氏菌抗原成分，将CFSE标记的布鲁氏菌 M5和PKH-26标记的巨噬细胞共培养，12小时后提取微粒并通过共聚焦显微镜观察。微粒中的红色染色区域含有绿色染色的布鲁氏菌成分（图1C）。

讨论

微粒已成为细胞间通讯的关键介质，通过精确传递生物活性分子来调控复杂的免疫过程（Mause和Weber，2010年）。这些膜结合的囊泡最初是在滤泡树突状细胞向T淋巴细胞呈递抗原的过程中被发现的，现在被认为是多功能的免疫调节平台（Szakal等人，1988年）。最近的研究表明，它们能够运输多种

结论

总之，我们的研究结果表明，来自布鲁氏菌感染细胞的巨噬细胞衍生的微粒是多功能免疫原，能够引发强烈的Th1偏向性适应性免疫。通过将抗原传递与内在佐剂活性相结合，MPs-M5为针对细胞内病原体的新型亚单位疫苗提供了一个有前景的平台。这些结果阐明了DC激活和CTL介导的细胞毒性的机制，并为布鲁氏菌病的控制策略奠定了基础。

声明

无

伦理批准和参与同意

所有动物实验均获得了石河子大学生物伦理委员会的批准，并按照委员会的建议进行（批准号A2024-441，见附件1）。

资助

本研究得到了石河子大学国际科技合作促进计划（编号GJHZ202203）、国家自然科学基金（82160391）、石河子市第八期科技计划项目（2024SF01）、生产建设兵团指导性科技规划项目（2023ZD065）、贵州省教育厅青年优秀科技人才项目（QJJ[2024]347）的支持。

CRediT作者贡献声明

盛金良：监督、资源提供。袁静：撰写——初稿、概念构思。张长锁：监督。张玉婷：撰写——初稿、数据管理、概念构思。徐明国：资源提供。王泽轩：研究、数据管理。马中晨：正式分析。吴傲迪：撰写——初稿、概念构思。王月丽：撰写——审稿与编辑、监督、概念构思。李红环：撰写——审稿与编辑、数据管理。孟创：

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢Liwen Bianji（Edanz）的Lisa Oberding（www.liwenbianji.cn）编辑了本手稿的英文版本。

利益冲突

所有作者均声明没有利益冲突。

出版同意

不适用。

附件1

石河子大学生物伦理委员会批准函