ABSTRACT
隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种引起隐孢子虫病的原生动物寄生虫，这种肠道感染与中低收入国家的腹泻、营养不良和儿童发育受损相关。虽然体液和细胞免疫应答均被证实与保护作用相关，但免疫健全成人对隐孢子虫的人类免疫应答的持久性和质量仍不明确。本研究调查了两名前往孟加拉国旅行期间感染原发性隐孢子虫病的健康美国成人的免疫力发展情况。通过分析纵向血浆样本，评估了对隐孢子虫抗原Cp17和Cp23的抗体应答以及循环细胞因子谱。循环抗体在感染后3周达到峰值，但此后迅速下降，在16周内接近基线水平。相比之下，抗体亲和力随时间稳步增加，与生发中心中持续的亲和力成熟一致。尽管发生了亲和力成熟，但针对隐孢子虫抗原的记忆B细胞组成在不同时间点均偏向IgM+细胞，表明滤泡外应答占主导，而生发中心来源的类别转换记忆有限。细胞因子分析揭示了急性Th1偏向的应答，在感染早期CXCL9、CXCL10、IL-27、IFN-γ、IL-12和IL-18升高。这些特征反映了小鼠模型中发现的保护性通路，强调了I型免疫在寄生虫清除中的重要性。总之，这些发现突出表明，虽然对隐孢子虫的抗体应答是短命的，但亲和力成熟持续存在，并且在急性感染期间Th1驱动的细胞因子应答占主导地位。这项工作为自然感染隐孢子虫后初始成人的免疫应答提供了罕见的纵向数据，并为可能指导疫苗开发和减轻易感人群反复感染风险的机制提供了见解。
INTRODUCTION
隐孢子虫是引起隐孢子虫病的原生动物寄生虫，这是一种以水样腹泻为特征，在某些情况下伴有严重脱水和水土不服的肠道感染。疾病负担在低收入和中等收入国家尤其高，在幼儿期反复感染与生长迟缓、认知发育受损和死亡率增加相关。尽管隐孢子虫具有全球重要性，但我们对介导人类隐孢子虫感染保护和消退的免疫应答的理解仍然不完整。细胞介导和体液免疫机制都与防御隐孢子虫有关。流行病学和实验研究表明，T细胞介导的免疫对于寄生虫清除至关重要。这种对隐孢子虫病的T细胞介导保护主要由I型（Th1）细胞因子应答驱动，即IFN-γ、IL-12和TNF-α。现有数据表明B细胞应答和抗体也有助于限制再感染。缺乏B细胞类别转换重组（通常由于编码CD40配体（CD40L）的基因突变）的个体易患隐孢子虫慢性感染。针对隐孢子虫抗原Cp17和Cp23的粪便抗体与延迟再感染时间和隐孢子虫相关腹泻频率降低相关。然而，在没有后续再暴露的情况下，自然感染后抗体应答的持久性和功能质量尚未明确界定。同样，尽管细胞因子产生已在动物模型中进行了研究，但关于急性感染和恢复期细胞因子应答动力学的人类数据仍然有限。为了解决这些空白，我们研究了两名免疫健全成人在没有后续再暴露情况下的原发性隐孢子虫病的免疫应答。收集纵向血浆和外周血单核细胞（PBMC）样本，以评估（i）通过随时间变化的抗体数量和亲和力以及针对Cp17和Cp23抗原的记忆B细胞的免疫球蛋白亚型分型来评估体液免疫，以及（ii）通过循环细胞因子水平推断细胞介导的免疫。我们的分析显示，针对隐孢子虫Cp17和Cp23抗原的抗体水平在感染后3周达到峰值，但在疾病消退后迅速下降。针对隐孢子虫抗原的记忆B细胞组成在不同时间点均偏向IgM+细胞。血浆细胞因子分析证明了与T辅助1细胞和细胞毒性T细胞活化相关的急性IFN-γ依赖性应答，表明细胞介导的免疫在控制感染中起核心作用。了解这些免疫通路的相对贡献和局限性可能为疫苗开发和预防易感人群反复感染的策略提供信息。
MATERIALS AND METHODS
样本采集：血液样本采集于EDTA抗凝管中。通过以2,000 × g离心15分钟获得血浆，移取上层液体层，并分装储存于-70°C。然后，向采血管中加入三倍于移出血浆体积的PBS加2%胎牛血清（FBS）并颠倒混匀。将稀释的样本加在淋巴细胞分离液上，以450 × g离心30分钟，收集PBMC层。用PBS加2% FBS洗涤PBMC。将细胞沉淀重悬于含10% FBS的RPMI中，然后加入等体积的2×冻存液，于-70°C冷冻后长期储存于液氮中。
隐孢子虫抗体测量：酶联免疫吸附测定（ELISA）板用5μg/mL Cp17或Cp23蛋白在4°C包被过夜。用含0.05% Tween 20的PBS洗涤三次，用ELISA封闭液在37°C封闭1小时，再次洗涤（3次）。将稀释1:150或1:1500的血浆样品四复孔加入，在37°C孵育1小时。洗涤（3次）后，每个样品的两个孔用0.5M NH4SCN在室温处理15分钟。再进行一次洗涤（3次），然后加入HRP标记的抗人IgM、IgA或IgG，在37°C孵育1小时。最终洗涤（3次）后，加入TMB Turbo ELISA底物作用7.5分钟。然后，用2N H2SO4终止反应，读取450 nm处的吸光度值并用570 nm处的吸光度值校正。
抗原四聚体和流式细胞术：抗原四聚体用于鉴定抗原特异性B细胞。简言之，重组Cp17和Cp23蛋白进行生物素化，未反应的生物素通过尺寸排阻柱去除，然后与荧光标记的链霉亲和素孵育。为排除结合链霉亲和素和荧光染料的B细胞，平行生成对照"诱饵"四聚体。重组Cp17和Cp23蛋白在其N端含有一个无关的His标签蛋白，因此将生物素化的His标签对照蛋白与额外的荧光标记链霉亲和素结合，以提供与抗原四聚体不同的光谱特征。
对于Cp17和Cp23 B细胞表型分析，将第1、3、5和16周的PBMC在含10% FBS的温RPMI中解冻，并立即在含Live/Dead Blue染料的PBS中孵育。然后在FACS缓冲液（2% FBS, 0.5 mM EDTA）中与人TruStain FcX Fc受体阻断剂、Cp17和Cp23抗原四聚体以及诱饵四聚体一起孵育10分钟。然后加入所有剩余的表面标志物，孵育30分钟。染色后的细胞在洗涤后立即通过光谱流式细胞仪获取，随后的数据通过对所有时间点的总活细胞数进行等量二次抽样进行标准化。
细胞因子和生物标志物定量：使用ELISA试剂盒按照制造商说明测量1:200稀释血浆中的C反应蛋白。所有其他细胞因子测量使用多重Luminex微球检测法在UVA流式细胞术核心设施按照制造商方案进行。
统计分析和数据可视化：由于样本量小（N=2），未对仅从受试者A和B生成的数据进行统计检验。对孟加拉国和美国受试者在首次隐孢子虫感染后3周的合并分析，分别通过Mann-Whitney U检验和Student t检验检测抗体数量和亲和力的显著差异。主成分分析图使用R语言的ggplot2包生成。代表性流式细胞术图使用OMIQ分析平台生成。抗原四聚体的示意图在Biorender中生成。所有其他可视化在GraphPad Prism中完成。
RESULTS
病例描述：2024年12月，一名30岁女性（受试者A）和一名18岁女性（受试者B）分别在美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔的门诊就诊，主诉为水样腹泻。受试者A和B最近一起前往孟加拉国旅行，并在腹泻症状出现前1周返回美国。在孟加拉国期间，患者访问了迪纳杰布尔和坦盖尔地区的农村地区以及首都达卡的城市社区。基于PCR的粪便胃肠道病原体检测显示两名患者隐孢子虫属阳性。受试者A另外检测出肠致病性大肠杆菌（EPEC）阳性。受试者B另外检测出产肠毒素大肠杆菌（ETEC）和产志贺样毒素生物体阳性。根据潜伏期判断，隐孢子虫病被确定为腹泻症状的原因。两名受试者在研究前均无隐孢子虫病病史。两名受试者在急性感染期间均报告了5天的腹泻发作。急性疾病期间，受试者A体重减轻4.6磅（总体重的3.3%）。在急性症状消退后，受试者A经历了数周厌食，并在研究期结束时进一步减轻2.7磅。受试者B在急性疾病期间体重减轻3磅（总体重的2.5%），在腹泻消退后三周内恢复。两名患者均接受了口服阿奇霉素片治疗。
隐孢子虫特异性抗体在循环中快速衰减而亲和力持续增加：通过检测针对已知抗原Cp17和Cp23的抗体验证了隐孢子虫属感染。Cp17和Cp23是隐孢子虫来源的抗原，先前已被确定为潜在的疫苗候选物。这两名受试者均产生了体液免疫应答，在研究期的第3周达到峰值，并在最终的第16周时间点衰减至接近基线。该抗体应答的亲和力（B细胞成熟的标志）在研究期间普遍增加。受试者A在第16周时间点对所有抗体类别（IgM, IgG, IgA）和两种抗原（Cp17, Cp23）的亲和力均高于第3周的测量值。将这些结果与在收集首次隐孢子虫阳性粪便样本后3周采样的1岁和2岁孟加拉国儿童的测量值进行比较。美国成人受试者在抗体产生量和抗体亲和力方面与孟加拉国儿童相似。这些数据共同表明，原发性隐孢子虫病一致地导致针对Cp17和Cp23抗原的循环抗体；然而，水平在感染后仅几周就开始迅速下降。相比之下，抗体亲和力在几个月内持续增加，无需第二次隐孢子虫暴露。
感染后IgM+隐孢子虫特异性循环记忆B细胞占主导：抗体产生的质量由抗原特异性B细胞的分化途径决定。使用荧光标记的抗原四聚体来识别感兴趣的隐孢子虫B细胞。使用诱饵四聚体来识别非特异性染色。在两受试者中均鉴定出Cp17和Cp23特异性B细胞。在感染后16周期间，抗原特异性B细胞计数波动，对于两种抗原，受试者A在第3周达到峰值，受试者B在第5周达到峰值，表明B细胞应答的早期扩张阶段和随后的在第16周减弱。按亚组分析的B细胞计数显示出不同的动力学。记忆B细胞呈现出与总抗原特异性B细胞计数相似的时间模式，在第3周或第5周左右达到峰值。双阴性（DN）B细胞随时间保持相对稳定。抗体分泌细胞在第3周短暂升高，与急性感染后的早期浆母细胞应答一致。
接下来进行了抗原特异性B细胞的同种型分析，作为类别转换的指标。所有CD27+B细胞的抗原特异性同种型分析揭示了IgM主导的应答，特别是在受试者A的第3周以及两名受试者在第3周之后。IgG同种型在感染后期增加，提示随时间类别转换增加，而IgA同种型在两名受试者和两种抗原中均集中在第3周的急性感染期。这些模式在Cp23中比在Cp17中更明显。值得注意的是，DN B细胞亚群1和3在所有时间点均占比例主导。
受试者间差异和感染后时间塑造循环细胞因子谱：接下来使用Luminex 47重检测 panel 量化每个时间点的循环细胞因子，以了解对隐孢子虫病的免疫应答。主成分分析（PCA）显示样本按受试者在主成分1（PC1）上分离，按时间点在PC2上分离。评估了哪些细胞因子对PC1和PC2贡献最大，以分别确定表征受试者间和时间点变异性的应答。
PC1受细胞生长和伤口修复驱动因素的影响最大。与受试者B相比，受试者A中较高的伤口修复因子水平可能表明肠道损伤和疾病严重程度增加，这与受试者A中观察到的体重减轻增加、长期厌食和较高的C反应蛋白（CRP）一致。然而，鉴于只有两个个体的样本量小，受试者间的变异性难以评估。
对PC2影响最大的细胞因子是CXCL9、CXCL10和IL-27。这组细胞因子在两名受试者的第1周急性感染时间点与所有后期时间点相比均升高。值得注意的是，CXCL9、CXCL10和IL-27均与1型（Th1）免疫特征相关。这些细胞因子数据共同表明，虽然生长因子可能在受试者间变异，但驱动Th1应答增加的信号分子是急性隐孢子虫病免疫应答的重要标志。
隐孢子虫病小鼠模型关键分子的细胞因子谱：接下来检查了先前与隐孢子虫免疫力相关的细胞因子浓度。IFN-γ对于驱动针对寄生虫的防御和限制小鼠模型中的感染严重性至关重要。类似地，IFN-γ的诱导剂，包括IL-12和IL-18，对于针对隐孢子虫的早期应答很重要；并且在缺乏强大IFN-γ产生的情况下，TNF-α已被证明在小鼠中提供保护。在本研究中，血浆IFN-γ在受试者B的急性感染早期达到峰值，随后在后续时间点减弱。相比之下，受试者A在整个研究期间保持高IFN-γ水平。对于TNF-α、IL-18和IL-12p40亚基，两名受试者均在第1周测量值最高，然后在后期时间点下降。
IL-4通过与IFN-γ协同作用在寄生虫清除中提供支持作用，但此外还通过促进免疫球蛋白类别转换调节获得性免疫的发展。CD40与其配体的结合也有助于获得性免疫的发展，小鼠中这种相互作用的丧失导致无法清除隐孢子虫。在本研究中，可溶性CD40配体（sCD40L）在两名受试者中在第3周时间点出现峰值，而IL-4在研究期间保持恒定或轻微增加。
DISCUSSION
我们量化了其他方面健康、免疫健全的成人对原发性隐孢子虫病的循环抗体产生的持久性和功能质量，以评估体液免疫应答。并行地，我们测定了细胞因子产生作为细胞介导免疫的代理，以衡量人类应答与隐孢子虫感染小鼠模型中观察到的应答的比较。这项工作的主要发现是（i）观察到初始峰值后循环隐孢子虫特异性抗体的快速衰减，（ii）在所有时间点比例上IgM占主导的记忆B细胞，以及（iii）证实了小鼠模型中看到的Th1细胞因子应答对于指示自然人类感染过程的相关性。
隐孢子虫特异性抗体在循环中寿命短：针对病毒和细菌抗原的循环抗体和记忆B细胞的寿命可以是长久的。例如，循环IgG SARS-CoV-2刺突蛋白滴度在COVID-19症状出现后3周起至约8个月内基本稳定。针对痘苗病毒的循环IgG和记忆特异性B细胞在接种后60年仍可检测到。与这些病毒病原体类似，细菌耶尔森菌属（常见的胃肠炎致病菌）导致IgM、IgG和IgA的长循环抗体半衰期，在36个月内缓慢衰减。接种先前的口服伤寒疫苗候选物CVD 909导致针对伤寒沙门菌抗原的IgA+记忆B细胞在给药后1年仍显著升高。相比之下，针对原生动物寄生虫的体液免疫通常被认为是短命的。据报道，恶性疟原虫感染的抗体应答在感染消退后几周内迅速下降。类似地，针对隐孢子虫抗原Cp17和Cp23的循环抗体未能在我们的受试者中持续高水平存在。相反，我们观察到抗原特异性免疫球蛋白在感染后3周达到峰值，随后迅速下降，这在感染后仅5周就很明显。
虽然血浆抗体浓度在感染后几周开始减弱，但抗体亲和力在缺乏再暴露的情况下持续增加。抗体亲和力预计在暴露后随时间增加，这是由于亲和力成熟以更好地靶向病原体表位。在单次暴露后，亲和力增加并达到平台期的持续时间因病原体和个体因素而异。然而，该参数通常在原发性感染后几个月逐渐成熟，然后稳定，除非有后续暴露。在病原体被清除且循环中检测不到抗原后，生发中心活动持续，被认为是由于滤泡树突状细胞能够保留抗原-抗体复合物和补体结合抗原数周至数月。与此一致，我们的受试者在所有情况下感染后5周的亲和力高于感染后3周，并且在大多数情况下感染后16周的亲和力仍然更高。这些数据表明，虽然与许多感染背景相比，原发性隐孢子虫病后循环抗体浓度下降更快，但生发中心中的亲和力成熟仍然存在。
感染后隐孢子虫特异性IgM+循环记忆B细胞占主导：除了循环抗体数据外，我们对抗原特异性B细胞的分析阐明了原发性感染后B细胞应答的动力学。Cp17和Cp23特异性B细胞在感染早期扩增，每名受试者在第3-5周达到峰值，然后在第16周收缩。这在记忆B细胞的频率中得到反映，而双阴性B细胞相对稳定，抗体分泌细胞在第3周短暂升高。这些动态是急性应答的典型特征：抗原特异性淋巴细胞的早期爆发，随后随着抗原清除而收缩。虽然这不反映驻留在组织中、未在外周血中捕获的长寿命浆细胞和记忆B细胞，但循环抗原特异性B细胞的减弱与我们观察到的短命抗体应答一致，并让人想起其他顶复门感染，如疟原虫，其中B细胞迅速扩增但在没有重复暴露的情况下下降。
CD27+B细胞的表型组成显著偏向IgM+记忆B细胞。对于Cp17和Cp23，表达IgM的细胞在所有时间点构成了大多数抗原特异性记忆B细胞，而IgG+细胞随时间仅适度增加，IgA+细胞在早期（第3周）达到峰值。IgM+记忆B细胞的主导地位也在其他顶复门感染中被描述；例如，疟原虫特异性IgM+记忆B细胞是体细胞超突变的，并在再攻击时充当快速、可塑的应答者。此类IgM+记忆B细胞可能有助于早期寄生虫控制，但通常是短命的，可能无法维持长期抗体产生，这与我们观察到的循环抗体快速下降一致。这种偏向可能反映了有限的类别转换，可能是由于滤泡辅助性T细胞应答或细胞因子环境不理想。我们的受试者仅表现出IL-4的适度变化和可溶性CD40配体的短暂峰值，这些是驱动生发中心反应和同种型转换的细胞因子。因此，虽然发生了亲和力成熟，但IgM+记忆的主导表明滤泡外应答可能占主导，而生发中心来源的类别转换记忆有限。
DN B细胞亚群的分析提供了对体液应答性质的额外见解。缺乏CD21和CD11c并与滤泡外活化相关的DN3 B细胞在急性感染期（第3周）占主导，但此后收缩。相比之下，表达CD21并被认为代表生发中心来源的记忆B细胞前体的DN1细胞在第16周更为突出。这种时间转变表明早期应答由滤泡外通路驱动，而后期出现了生发中心样应答，可能有助于观察到的抗体亲和力增加。这种有限的生发中心应答，加上主导的IgM+记忆B细胞，可能解释了为什么隐孢子虫病通常无法诱导持久的灭菌免疫力，以及为什么即使在流行地区再感染也很常见。
细胞因子谱证实了Th1免疫应答对隐孢子虫病的重要性：使用受控人类感染模型（CHIMs）研究隐孢子虫病的研究很少，最近一项使用人隐孢子虫或微小隐孢子虫的此类研究发表于近二十年前。来自CHIM研究的有限数据集中于量化感染剂量和参与者抗隐孢子虫血清转化率。关于自然人类感染的流行病学数据已在巴西、孟加拉国、海地和其他国家的人类队列中收集。这些队列通常由营养不良的个体组成，并生活在高传播地区，导致纵向采样期间存在再暴露可能性。我们的研究，尽管样本量小，提供了一个独特的机会来研究在没有再暴露的情况下，初始、免疫健全的成人对隐孢子虫的免疫力随时间发展。我们的发现很大程度上证实了来自人类队列采样和转基因小鼠模型的结果。我们研究中的细胞因子分析表明了一种以高CXCL9、CXCL10和IL-27为标志的急性IFN-γ依赖性Th1应答。在其他隐孢子虫病研究中，与未感染的艾滋病患者或健康对照相比，艾滋病合并隐孢子虫感染患者的肠道活检中CXCL10浓度增加。在正常宿主中，IFN-γ诱导的CXCL9和CXCL10募集CXCR3阳性效应细胞以控制寄生虫负荷。虽然关于IL-27作用的直接证据较少，但这种细胞因子通过诱导IFN-γ促进Th1免疫应答。IL-27是IL-12细胞因子家族的成员；IL-12是小鼠防御隐孢子虫的关键细胞因子，它与IL-18在先天和适应性免疫的交叉点协同作用以驱动IFN-γ应答。CXCL9、CXCL10、IL-27、IL-12和IL-18的增加均表明在急性隐孢子虫感染期间诱导了IFN-γ驱动的Th1应答，尽管实际IFN-γ浓度的变化更为细微。应该指出的是，阿奇霉素作为旅行者腹泻的一线治疗，分别在受试者A和B的第1周抽血前4天和3天首次给药。在此时间范围内不太可能实现细菌病原体的完全根除。因此，循环细胞因子可能也受到受试者对细菌合并感染的免疫应答的影响。
目前的工作突出了人类和小鼠对隐孢子虫的细胞因子应答谱之间的广泛相似性。然而，这些细胞因子在人类中的下游效应器不能假定与小鼠系统相同。在小鼠中，免疫相关的GTP酶是IFN-γ诱导的对病原体应答的关键介质。该通路在人类中 largely absent，并且人类中IFN-γ和其他Th1相关细胞因子下游的关键细胞内在介质定义较少。因此，未来的研究需要以物种特异性方式阐明负责控制隐孢子虫的Th1相关细胞因子下游的效应器通路。
Th1相关细胞因子和趋化因子可能塑造了本研究中观察到的抗原特异性B细胞轨迹。IL-12本身可以直接偏向滤泡外应答并抑制生发中心应答。同时，IFN-γ诱导的趋化因子CXCL9和CXCL10可能指导了CXCR3表达B细胞的迁移并支持外周组织中的浆细胞分化，可能偏向快速的IgM输出而非持久的生发中心发育。相比之下，与Tfh细胞存活和生发中心维持相关的IL-27在第1周后稀缺，并且仅观察到可溶性CD40L的短暂增加，与抗原特异性B细胞的峰值相吻合，这可能为类别转换重组和亲和力成熟提供了一个短暂的窗口。因此，观察到的细胞因子环境可能使平衡偏向快速、先天样B细胞应答而非强大的生发中心反应，从而有助于在抗原特异性B细胞表型中观察到的免疫学足迹。
此外，阿奇霉素治疗可能促成了我们观察到的免疫模式。除了其抗菌活性外，阿奇霉素对巨噬细胞和树突状细胞中NF-κB和AP-1信号传导的抑制预计会减少IL-27产生并限制共刺激通路，如CD40/CD86-CD40L，这与我们观察到的短暂IL-27和可溶性CD40L应答一致。此外，阿奇霉素通过降低ICOS、OX40和mTOR信号传导直接抑制T细胞活化，这可以限制Tfh细胞增殖和生发中心支持。阿奇霉素还抑制促炎细胞因子，如IL-12，同时增强IL-10，创造一个可能限制Th1和Tfh驱动应答持久性的调节环境。这些效应预计会破坏持续的Tfh支持和生发中心形成，有利于短命的滤泡外B细胞活化和IgM偏向的抗体输出，正如在我们的队列中所见。因此，虽然宿主应答驱动了对隐孢子虫的免疫力，但初始的阿奇霉素治疗可能抑制了T和B细胞应答的强度和持久性。
总之，我们的研究提供了对在没有再暴露的情况下，其他方面健康的成人原发性隐孢子虫病免疫应答的罕见纵向观察。我们证明循环隐孢子虫特异性抗体水平短暂升高，但在感染消退后迅速减弱，而亲和力在几个月内持续成熟，反映了持续的B细胞活性。同时，细胞因子分析揭示了主导的Th1驱动应答，以IFN-γ、CXCL9、CXCL10、IL-27、IL-12和IL-18为标志，与动物模型和先前人类研究中发现的保护性通路一致。抗原特异性B细胞的详细表型分析显示，Cp17和Cp23特异性群体早期扩增但迅速收缩，应答由IgM+记忆亚群主导，表明依赖于滤泡外通路而非持久的生发中心活性。支持这一点的是，IL-27产生是短命的，可溶性CD40L信号是短暂的，都指向对持续类别转换的有限Tfh支持。抗体水平减弱、IgM主导和短暂的Tfh相关信号相结合，突出了单次暴露后产生长效体液免疫的限制。这些发现强调了细胞介导免疫在控制感染中的核心作用，同时突出了单次暴露后体液保护持久性的局限性。尽管仅基于两个病例，这项研究强调了在自然人类感染中进行详细免疫学分析的价值，并为未来旨在确定保护相关因素的工作奠定了基础。这些见解对于指导疫苗开发和设计预防易感人群反复感染隐孢子虫病的策略至关重要。
ACKNOWLEDGMENTS
我们感谢弗吉尼亚大学Petri和Taylor实验室的成员在技术帮助和富有洞见的讨论方面的贡献。我们也感谢弗吉尼亚大学流式细胞术核心设施的技术支持。
这项工作得到了NIH拨款AI043596和Manning家庭基金会研究捐赠的支持，均授予W.A.P.。A.C.B.得到了PhRMA基金会转化医学博士后奖学金的支持。
