综述：关于细胞外囊泡储存稳定性的全面综述，以促进其临床应用：当前状况、挑战及前景

外泌体保存技术及对质量属性的影响。本文综述了冷冻、喷雾干燥和冷冻干燥等保存方法，分析储存条件对膜完整性、生物活性、免疫原性等关键质量属性的影响，提出针对诊断标记、药物递送和细胞疗法的差异化保存要求，并探讨优化策略如新型保护剂、改进缓冲液及稳定材料技术，强调标准化保存方法对临床转化的重要性。

黄海|徐文杰|郝新燕|孙鹏程|郭梦根|李慕燕|刘新英|彭彦金|韩如月|唐天添|唐玉成|向大雄|王明|吴俊勇

中南大学第二湘雅医院药学系，中国长沙410011

摘要

细胞外囊泡（EVs）如今被视为下一代诊断、靶向药物递送和无细胞疗法的强大工具。然而，它们的临床应用受到存储挑战的限制——保存过程会损害它们的结构和活性。本综述总结了目前用于保存EVs的方法，包括冷冻保存、喷雾干燥和冷冻干燥。同时，还讨论了不理想的存储条件如何影响EVs的关键质量属性（CQAs），包括膜完整性、 cargo稳定性、生物活性、免疫原性和回收效率。本综述采用以应用为导向的方法，强调了作为诊断标志物、递送载体或治疗剂的EVs的不同稳定性要求。此外，还评估了新的优化策略，如合理的冷冻保护剂配方、改进的缓冲液配方、减少吸附的存储材料以及先进的基于材料的稳定技术。最后，本综述概述了未来的发展方向，强调需要采用标准化和可扩展的保存方法，以加速基于EV的技术从实验室向临床实践的转化。

引言

细胞外囊泡（EVs）是细胞间通信的纳米级媒介，能够运输影响各种生理和病理过程的生物活性物质[1]、[2]、[3]。根据其生物生成途径，EVs传统上被分为三种亚型：凋亡小体、微囊泡（MVs）和外泌体[4]、[5]、[6]。由于它们在大小范围和表面标记物上的显著重叠，且缺乏统一的标准分离方法，准确区分这些亚型极具挑战性[7]、[8]。因此，除非特别讨论某种亚型，否则本综述将使用“EVs”这一通用术语。作为下一代诊断工具、药物递送系统和无细胞疗法，EVs在转化医学领域具有巨大潜力[9]、[10]、[11]。然而，这一前景是否能在临床环境中完全实现，关键在于克服存储不稳定性这一重大挑战。越来越多的证据表明，不理想的存储条件会引发有害的物理和化学变化，包括聚集、膜破裂和内容物泄漏，这些都会严重损害EVs的治疗效果和诊断可靠性[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。然而，不同研究的结果并不一致，有时甚至相互矛盾。这种异质性主要是由于不同研究中使用的EV来源、分离技术和表征方法存在差异[9]、[18]、[19]。例如，与来自巨噬细胞系的EVs相比，来自牛奶的EVs具有更强的冻融耐受性[20]；唾液来源的EVs可以在4°C下稳定保存数月[21]，而其他来源的EVs在该温度下会迅速降解[22]。除了经验观察外，EV稳定性的分子决定因素也在逐渐被阐明。例如，研究发现，来自不同细胞系的EVs在冷冻稳定性上的差异归因于特定的蛋白质组特征，特别是tetraspanin 4（TSPAN4）的丰度[23]。TSPAN4通过胆固醇依赖的相互作用稳定EV膜，从而赋予EV对冷冻的抵抗力，为EV对冷冻保存的耐受性差异提供了机制解释[23]。

至关重要的是，目前大多数研究采用以来源为中心的策略，专注于为特定生物液体（如血液或尿液）定制存储方案[14]、[24]、[25]。这种策略往往忽略了更关键的因素：预期的临床应用。作为诊断生物标志物、药物递送系统或治疗剂的EVs，其稳定性要求存在根本差异——对于前者来说，保持特定载荷（如miRNA）的完整性至关重要；而对于后者来说，保持整体生物功能是主要目标[26]、[27]。

为了进一步推动EVs向临床应用的深入转化，有必要系统地探索针对临床应用的存储稳定性。总体而言，本综述全面总结了现有的保存策略，包括冷冻保存、喷雾干燥和冷冻干燥技术。同时，还批判性地评估了存储条件对EVs关键质量属性（如膜完整性、内部载荷完整性、功能性生物活性、免疫原性和一致性）的影响。其次，本综述从三个主要临床领域（例如诊断生物标志物、药物递送系统和无细胞疗法）的角度系统评估了EVs的相应存储要求。这旨在更准确地了解EVs在不同应用环境中的存储稳定性特征和要求。最后，我们提出了有前景的优化策略，并提出了未来的研究方向，以促进基于EV的技术在临床实践中的稳定转化。

章节片段

当前的EVs保存技术和稳定剂

EVs的长期稳定性是其在临床应用中成功的关键因素。保存技术对于维持EVs的生物活性及其结构和载荷完整性至关重要。这对于确保其在各种应用（包括诊断、靶向药物递送和治疗）中的有效性至关重要。因此，本节详细探讨了当前的EV保存方法，

存储条件对EV关键质量属性（CQAs）的影响

EVs的存储稳定性是一个多方面的挑战，由一系列相互关联的CQAs构成[71]、[72]。核心属性——膜完整性、载荷稳定性、效力、安全性和回收效率——对EV的功能至关重要，并直接决定了其临床效用（图2）。例如，诊断性能需要完整的生物标志物，治疗效果取决于保存后的生物活性，而递送效率则需要稳定的载荷保持。本节将对此进行探讨

EVs的临床应用：存储要求和转化挑战

EVs的内源性特性为其在转化医学中的巨大潜力奠定了基础。然而，要在临床实践中实现这一潜力，完全取决于从实验室到临床的整个过程中保持其结构和功能的完整性。因此，保存策略不能一概而论，而必须根据特定应用的稳定性需求进行定制。本节详细阐述了EVs的三个主要临床应用：诊断、治疗和药物递送

优化策略以提高EVs的临床存储稳定性

如上所述，EVs的临床转化受到传统存储方法的固有限制，特别是对标准缓冲液（如PBS）和-80°C冷冻保存的依赖。这些限制——包括严格的冷链要求、高昂的成本、不可逆的冻融损伤、缓冲液引起的不稳定性和吸附损失——共同导致了EV质量和功能的下降。为了突破这一转化瓶颈，需要

结论与未来展望

EVs正处于一个关键时刻，它们独特的生物特性有望彻底改变诊断、药物递送和再生医学。然而，将这一巨大潜力转化为实际的患者益处，关键在于克服一个重大障碍：确保其稳定性。正如本综述所详述的，传统的保存方法往往不足，导致结构损伤、载荷丢失和功能受损，从而削弱了临床效果

CRediT作者贡献声明

黄海：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、研究、概念化。徐文杰：撰写——审稿与编辑、研究。郝新燕：研究。孙鹏程：验证。郭梦根：验证。李慕燕：方法学。刘新英：研究。彭彦金：方法学。韩如月：方法学。唐天添：研究。唐玉成：验证。向大雄：方法学。王明：监督、资源、研究。吴俊勇：监督，

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号82304424）、湖南省自然科学基金（资助编号2023JJ40860、2024JJ4081）、湖南省科技创新计划（资助编号2024RC3061）以及中南大学第二湘雅医院新员工科研启动项目（资助编号QH20230269）的支持。图形摘要、图1、图3、图4和图6由