腹部超声可以激活迷走神经的传入纤维，并产生抗炎作用

腹部超声通过激活副交感神经传入纤维抑制系统性炎症，机制涉及α7nAChR信号通路及孤束核（NTS）c-Fos表达。

摘要

腹部超声作为一种非侵入性手段，已被发现具有免疫调节潜力。尽管其在多种疾病模型中的抗炎作用已被证实，但其潜在机制仍不清楚。先前的研究表明，超声通过脾脏中的α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）信号传导促进抗炎巨噬细胞的极化。然而，引发这一反应的上游事件尚未阐明。在这里，我们证明了腹部超声能够激活传入的迷走神经纤维并抑制全身炎症。在脂多糖（LPS）诱导的内毒素血症小鼠模型中，腹部超声显著降低了血浆中的TNF-α水平。这种抗炎效应可以通过膈下迷走神经切断术（SDVx）或传入迷走神经阻断来减弱。电生理记录显示，在超声刺激期间颈迷走神经活动增强，而腹腔内注射利多卡因可以消除这种增强，从而证实了腹部感觉传入纤维的激活。此外，腹部超声还诱导了孤束核（NTS）中c-Fos的表达，这与通过迷走神经传入信号的中枢激活一致。这些发现直接证明了腹部超声刺激了传入的迷走神经通路。

超声在临床诊断成像中得到广泛应用；然而，最近的研究强调了其作为治疗工具的潜力。在临床前模型中，脉冲腹部超声已被证明具有抗炎和器官保护作用。2013年的一项里程碑式研究首次证明，腹部超声可以减轻小鼠缺血再灌注模型中的急性肾损伤（AKI）1。此后，在广泛的病理情况下也报告了类似的治疗效果2–5。这些效应被认为是由于免疫细胞——特别是巨噬细胞——向抗炎表型极化所致。在这一过程中，α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）是一个关键分子，它存在于巨噬细胞上，是诱导抗炎（M2样）表型的关键开关。然而，超声刺激激活α7nAChR的上游信号仍不清楚，这成为将该方法优化用于临床应用的主要障碍。

α7nAChR是胆碱能抗炎通路（CAP）的一个已知下游效应器，该通路是由迷走神经刺激（VNS）启动的神经免疫反射回路6。典型的CAP包括以下步骤：迷走神经的激活、脾脏交感神经的参与、脾脏T细胞的激活释放乙酰胆碱（ACh），以及随后脾脏巨噬细胞上α7nAChR的激活，从而使巨噬细胞向抗炎表型转变。基于这一框架，这些环节中的任何一个都可能成为超声诱导的神经调节的目标。鉴于腹部内脏由迷走神经密集支配，先前的证据表明超声可以通过机械力刺激神经元7>，以及传入迷走神经输入在启动CAP中的关键作用8>，我们假设腹部超声通过激活迷走传入纤维来触发CAP并抑制全身炎症。在这项研究中，我们结合使用电生理记录、c-Fos免疫组化和基因方法来验证这一假设。

结果

我们首先在内毒素血症的小鼠模型中评估了超声的抗炎效果。C57BL/6J小鼠接受了10分钟的腹部超声刺激（脉冲模式，14 MHz），随后腹腔注射脂多糖（LPS；15 mg/kg），然后再接受10分钟的超声刺激。超声处理后血浆中的TNF-α水平显著降低，与接受电刺激颈迷走神经（VNS）的小鼠观察到的降低程度相当图1A。为了评估免疫基因表达的变化，我们对脾脏组织进行了定量实时PCR分析。超声刺激显著抑制了促炎细胞因子和M1巨噬细胞标记物的mRNA表达图1B，表明抗炎反应被激活。值得注意的是，在巨噬细胞特异性α7nAChR敲除小鼠（LysM-Cre:α7nAChR^flox）9中，对超声的反应减弱了图1C。这一发现表明α7nAChR在巨噬细胞上的作用参与了CAP。为了确定迷走神经是否介导了这一效应，我们使用了两种手术模型来破坏迷走神经信号传导。在进行了膈下迷走神经切断术（SDVx）的小鼠中，超声降低TNF-α的效果减弱了图1D。同样，在用辣椒素处理迷走神经的小鼠中——这种处理会损伤传入迷走神经纤维10——超声的效果也减弱了图1E。这些发现表明迷走传入通路参与了这一过程，我们进一步通过记录迷走神经活动进行了验证。

图1.

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腹部超声刺激通过类似CAP的机制通过迷走神经引发抗炎效应。A）腹腔注射LPS后血浆中的TNF-α水平升高，但腹部超声（US）刺激后降低。抑制的程度与颈迷走神经刺激观察到的相当。B）对脾脏的定量实时PCR分析显示，促炎细胞因子（Tnf、Ccl2、Il-1b、Il-12b）和M1巨噬细胞标记物（Nos2、Cd86）被US处理抑制。C）在巨噬细胞特异性α7nAChR敲除小鼠（LysM-Cre:α7nAChR^flox）中，Cre–小鼠在US刺激后TNF-α水平降低，而在Cre+小鼠中这种效应减弱。D）通过沿食道切断左侧和右侧迷走神经进行了膈下迷走神经切断术（SDVx）。在仅进行剖腹术的假手术组中，超声具有抗炎效果，而在SDVx组中，超声的效果减弱。E）在用辣椒素处理双侧颈迷走神经以选择性阻断传入迷走纤维的小鼠中，超声未能抑制炎症。

为了直接监测超声刺激期间的迷走神经活动，我们建立了一个电生理记录系统。在左侧颈迷走神经上放置了钩形电极，并实时放大和记录神经信号图2A。为了验证该系统，我们使用了ChATCre–ChR2小鼠，在这些小鼠中通道视紫红质-2选择性地表达在胆碱能神经元中11，12。蓝光刺激左侧迷走神经引发了复合动作电位，这证明了我们的记录系统的有效性，而不是传入机制的证据图2B。此外，静脉或腹腔注射胆囊收缩素（CCK），一种已知的迷走神经传入激活剂，也引发了神经活动，进一步验证了该系统图2C。未经激活的超声探头放置不会引发迷走神经活动。相反，超声的应用显著增加了迷走神经活动，而腹腔内注射利多卡因可以消除这种活动图2D，表明反应来源于腹部传入纤维。为了检查这种迷走神经激活是否到达脑干，我们在孤束核（NTS）——接收迷走神经传入信号的主要脑干核——进行了c-Fos的免疫组化分析，c-Fos是神经元激活的标志物。腹部超声显著增加了NTS中的c-Fos表达图2E，表明超声引起的迷走神经激活传递到了中枢自主神经系统。

图2.

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腹部超声激活了传入的迷走神经信号和中枢自主神经系统。A）颈迷走神经记录设置的示意图。B）使用光遗传学验证记录系统：蓝光刺激ChATCre-ChR2小鼠的颈迷走神经引发了复合动作电位，证实了神经激活。C）静脉或腹腔注射胆囊收缩素（CCK），一种已知的迷走神经激活剂，增加了迷走神经活动，进一步验证了记录设置。D）腹部超声（US）刺激显著增加了颈迷走神经活动。腹腔内注射利多卡因消除了这种激活，表明信号来源于腹部传入纤维。E）免疫组化分析显示，在US刺激后90分钟，NTS中的c-Fos表达增加，这与迷走神经传入纤维向NTS的激活一致。F）腹部超声激活胆碱能抗炎通路（CAP）的机制示意图。

讨论

先前的研究表明，刺激迷走传入通路可以引发抗炎效应8，11，12。在本研究中，我们证明了腹部超声激活了迷走传入信号并引发了抗炎反应图2F。我们研究的一个局限性是使用了辣椒素来抑制迷走传入纤维。辣椒素会破坏表达TRPV1的纤维，通常被用作针对传入纤维的方法；然而，一部分迷走传出神经元也表达TRPV1，这些纤维也可能受到影响13，14。因此，我们的发现并不能确定迷走传入纤维是唯一介导超声抗炎效应的通路。此外，除了迷走传入纤维之外，还有其他多个下游通路可能参与这些反应，需要进一步的研究来阐明这些机制。

超声的器官保护作用引起了广泛关注，不仅在急性疾病中，而且在关节炎等慢性疾病中也有报道其益处3>，并且超声对人类脾脏区域的影响也已得到记录15>。朝着临床应用迈进，有必要优化超声的参数，如强度、频率、位置以及通过皮肤的衰减效应。

材料与方法

实验方法见补充信息附录。