环状GMP-AMP合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激物（STING）信号通路是重要的先天免疫通路，是预期中的抗癌防御机制[1]。在癌细胞中，来自细胞质中的微核或染色质片段的双链DNA（dsDNA）可以被cGAS以非序列特异性的方式识别（图1）[2]。cGAS与dsDNA结合后会被酶激活，产生cGAMP和ATP、GTP，这些物质作为信号分子刺激内质网（ER）上的STING[3]。随后，STING-cGAMP复合物从内质网转移到高尔基体，启动TANK结合激酶1（TBK1）的招募，TBK1随后发生自磷酸化。活化的TBK1磷酸化STING的C端，使其能够招募干扰素调节因子3（IRF3）[4]。磷酸化的IRF3可以二聚化并转运到细胞核。此外，STING还招募IκB激酶（IKKs）来磷酸化IκBα，从而抑制核因子-κB（NF-κB），促进NF-κB进入细胞核。p-IRF3和NF-κB的转录激活触发了I型干扰素（IFNs）和干扰素刺激基因（ISGs）的表达[5]，进而激活JAK-STAT通路[6]。因此，cGAS-STING信号通路的激活通过产生各种免疫调节蛋白（如ISGs）来促进树突状细胞（DCs）的激活以及T细胞向肿瘤微环境（TME）的迁移和浸润[7]。然而，尽管肿瘤细胞中含有异常浓度的dsDNA，它们仍能上调负因子（如细胞因子信号抑制剂SOCS蛋白），这些蛋白会抑制IFN相关基因的表达[8]。此外，肿瘤细胞还可以调节促生存基因以抑制IFN信号诱导的细胞毒性反应，从而逃避免疫监视[9]。
外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（ENPP1）是一种II型跨膜糖蛋白，以同二聚体形式存在于质膜中，可以通过酶促转化为活性单体[10]。ENPP1结构由三个部分组成：一个含有76个氨基酸的细胞质域、一个含有21个氨基酸的短跨膜区域以及一个含有828个氨基酸的细胞外域[11]。特别是，ENPP1在细胞外空间水解免疫递质2′,3′-cGAMP，生成AMP和GMP[12]。产生的AMP在肿瘤细胞中进一步被CD73外核苷酸酶转化为腺苷（ADO），这会抑制效应T细胞在TME中的激活、存活和细胞因子（IFN-γ、TNF-α和IL-2）的产生[13]。因此，通过小分子抑制剂抑制ENPP1可以通过增强I型IFNs的产生并改变免疫抑制环境为促进免疫的环境，从而促进cGAS-STING信号通路介导的免疫反应，从而提高抗癌免疫治疗的疗效。值得注意的是，ENPP1抑制剂与传统化疗和免疫检查点抑制剂（ICIs）的联合使用正在临床前和临床研究中得到积极探讨[14]。
鉴于ENPP1抑制剂作为癌症免疫治疗的有希望工具的重要性，迄今为止已经报道了多种用于抑制ENPP1的小分子[图2]。
QS-1（1）是首个开发的选择性ENPP1抑制剂，其特征是含有喹唑啉核心和作为Zn结合剂的磺酰胺结构[15]。然而，1严重的心血管毒性（抑制hERG）和低效限制了其在临床试验中的适用性。此外，MV-658（2）用喹啉替换了喹唑啉结构，表现出强效的ENPP1抑制作用（IC50 = 15 nM），由Mavupharma于2019年开发[16]。在STF-1084（3）和STF-1623中，通过将磺酰胺单元替换为磷酸酸，探索了Zn结合基团的变体[17]、[18]。尽管STF-1084（3）表现出强烈的ENPP1抑制活性，但其细胞渗透性较低。最近，也研究了口服可吸收的ENPP1抑制剂，包括含有磺酰胺基Zn结合剂的酞嗪酮（4）、喹唑啉（5）、吡咯并嘧啶酮（6）和咪唑吡嗪（7）[19]、[20]、[21]、[22]。此外，Insilico Medicine开发了ISM5939（8），它含有咪唑吡啶核心和磺酰胺末端，旨在改善生物学特性和口服生物利用度，目前正处于I期临床试验阶段[23]。
作为首个选择性ENPP1抑制剂的例子，Riboscience在2022年开发了RBS2418[24]、[25]，它显示出良好的口服生物利用度和可接受的安全性和药代动力学特性。特别是，RBS2418与抗PD-1 pembrolizumab联合使用，诱导了T细胞的增殖并上调了T细胞中的细胞毒性颗粒蛋白基因表达，这有利于其在I/II期临床试验中的开发（NCT05270213）。此外，TXN10128正在I期试验中进行研究，作为一种口服活性的ENPP1抑制剂（NCT0598492）[26]，与抗PD-L1抗体联合使用时，促进了淋巴细胞浸润并抑制了MC38同源肿瘤模型的肿瘤生长。随后，还报道了其他强效的ENPP1抑制剂候选物，包括SR-8541A（Stingray Therapeutics）和ZX-8177（Zenshine Pharmaceuticals）[27]、[28]、[29]。遗憾的是，这些化合物的化学结构尚未公开。
开发新型ENPP1抑制剂的主要目的是用于癌症免疫治疗，特别是为了增强天然的抗肿瘤免疫反应。这种免疫激活可以使免疫冷肿瘤（缺乏显著免疫细胞浸润的肿瘤）转变为免疫热肿瘤或免疫活性肿瘤，使其更容易受到免疫攻击。因此，ENPP1抑制剂与现有ICIs的联合治疗有望提高治疗效果，特别是在使用现有抗癌药物难以治疗的晚期或转移性癌症中。为了设计新型ENPP1抑制剂，我们首先研究了ENPP1蛋白与MV-658（2）的对接模型，发现喹唑啉核心参与了与Lys295和Trp322残基的氢键结合以及与Tyr340和Phe257残基的π–π堆叠相互作用（图3）。
值得注意的是，磺酰胺功能协调Zn离子并与Asp375残基形成紧密的氢键，这是ENPP1抑制剂的一个特征性特征。接下来，我们根据药物发现中的支架替换策略，将MV-658（2）的喹唑啉核心替换为苯并三唑核心。有趣的是，9与ENPP1蛋白的氢键结合和π–π堆叠相互作用得以保持，尽管对接分数略有下降。随后，将9生物等立体修饰为10（含有磺酰胺基团），在计算机模拟对接研究中显示了磺酰胺基团与Asp375残基之间的氢键相互作用。为了验证化合物2、9和10的对接分数与生物活性之间的相关性，我们使用cGAMP作为底物，通过AMP-Glo测定法评估了它们对重组人ENPP1酶的体外抑制活性。MV-658（2）的IC50值先前确定为15 nM。苯并三唑衍生物9的活性略有下降（IC50 = 26 nM），但衍生物10的抑制活性与MV-658（2相当（IC50 = 19 nM），表明磺酰胺基团与Asp375残基之间的氢键相互作用在ENPP1抑制中起着关键作用。
