背景与概述
肝内胆管癌（Intrahepatic Cholangiocarcinoma, ICC）是仅次于肝细胞癌的第二大原发性肝脏恶性肿瘤，全球发病率和死亡率持续上升。手术是其标准治疗方法，但术后复发率高达54%-71%，导致患者预后不良。近年研究表明，肠道共生生态系统在疾病发生发展中扮演着关键角色。微生物群落组成的改变与肿瘤发生或进展密切相关，而血清中特定代谢物的变化也有助于识别ICC，并为早期诊断和治疗提供新靶点。然而，同时捕获ICC不同治疗阶段肠道菌群和全身代谢动态变化的整合分析研究仍有限。本研究旨在通过分析粪便微生物组和血清代谢组，识别与ICC复发相关的微生物和代谢特征，并描绘它们在不同疾病阶段的时间动态，以探索其内在关联。
ICC的微生物学分析
为探究与ICC相关的重要标志微生物，研究对117份ICC患者和50份健康人粪便样本进行了16S rRNA测序。样本分为正常组（N）、术前组（Pre-OP）、术后7天组（Post-7D）、术后1-3个月组（Post-1M）和复发后组（Post-R）。α多样性分析（香农指数和逆辛普森指数）显示，非正常组（包含所有癌症样本）与正常组存在显著差异。β多样性分析中，基于堪培拉距离的非度量多维标度分析也显示两组间存在显著差异。
在属水平上，Faecalibacterium、Bacteroides、Escherichia_Shigella和Subdoligranulum丰度占比最高且组间差异最大。差异分析进一步揭示，在非正常组中，Acinetobacter、Bacteroides、Veillonella和Enterococcus的丰度显著升高，而[Eubacterium]_hallii_group、Dorea、Halomonas、Lachnospira和Rickettsia的丰度显著降低。值得注意的是，拟杆菌属的丰度在非正常组中显著高于其他组。
肝内胆管癌的复发分析
为了解ICC不同时期微生物的动态变化，研究分析了117份ICC患者粪便样本。通过分析术前、术后7天、术后1个月和复发后四个时期细菌丰度的变化趋势，旨在深入了解手术治疗对患者微生物群的影响以及术后复发前后细菌种群的动态，并识别潜在的微生物标志物。韦荣球菌、肠球菌、消化球菌和乏养菌的相对丰度在不同时期存在显著差异。值得注意的是，肠球菌和乏养菌的丰度在术后1个月显著降低，而在复发后显著升高。
在四个时期中，拟杆菌属、韦荣球菌属和肠球菌属均有较高的代表性，且其丰度比例存在显著变化。该研究进一步证明拟杆菌的丰度可作为ICC的重要标志。此外，通过功能预测分析，鉴定出若干在四组间存在显著差异的功能通路，包括醚脂代谢、亚油酸代谢、色氨酸代谢、甘露糖型O-聚糖生物合成、香叶醇降解和II型聚酮化合物骨架的生物合成等。这些通路与代谢过程密切相关，对细胞生物功能和生理状态具有重要影响。
肝内胆管癌微生物群落复发的验证分析
为更高效、准确地研究胆管癌患者微生物群落组成，研究对56份患者粪便样本进行了宏基因组测序。在所有四个时期，拟杆菌、韦荣球菌和肠球菌均有高度代表性，且存在显著差异。在属水平上，四组间相对丰度存在显著差异的细菌包括乏养菌、肠球菌、乳球菌、消化链球菌和韦荣球菌。研究表明，胆管癌不同阶段韦荣球菌、肠球菌、消化球菌和乏养菌丰度的变化可作为疾病诊断或监测治疗效果的重要标志。
与之前16S测序结果一致，肠球菌的丰度在术后1个月组显著降低，而在复发后显著升高，表明其具有预测ICC患者复发的潜力。此外，功能预测分析鉴定出四组间存在显著差异的功能通路，包括多环芳烃降解、赖氨酸降解、类黄酮生物合成等，这些通路主要影响代谢功能。
肝内胆管癌的代谢物复发
为研究ICC患者代谢物的时间变化并识别早期生物标志物，研究对220份ICC患者血清样本进行了基于QE的代谢组学分析。不同时期代谢物丰度的差异分析显示，在正离子模式和负离子模式下，多个时期组间存在显著差异。
在正离子模式下，肌酐和L-精氨酸的比例最高，且在亚组间丰度差异最大；在负离子模式下，次黄嘌呤的比例最高且差异最大。两种模式下共有的差异丰度代谢物包括次黄嘌呤、肌酸、D-谷氨酰胺、犬尿喹啉酸、N4-乙酰胞苷、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-大尿氨酸、焦谷氨酸、亚油酸和胆酸。对这11种差异代谢物进行KEGG富集分析，显示它们主要影响与氨基酸代谢、脂质代谢、核苷酸代谢和生物合成相关的代谢通路。
微生物学与临床指标的相关性研究结果
研究测量了ICC患者的各项临床标志物。在四个时间点，肌酸激酶MB同工酶和天冬氨酸氨基转移酶水平存在显著差异。将显著差异的细菌与临床因素进行相关性分析。结果显示，消化球菌与γ-谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶和CA15-3显著相关；韦荣球菌与CA125和甲胎蛋白显著相关；总胆固醇与肠球菌相关，而肠球菌又与天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶和单核细胞计数显著相关；乏养菌与单核细胞计数显著相关。
基于总生存期和无复发生存期对四个样本时期进行的生存分析显示，时期之间的生存差异无统计学意义。然而，基于四种关键标志菌丰度的生存分析表明，韦荣球菌和肠球菌丰度的变化可影响胆管癌患者的预后。结合临床因素和细菌丰度的Cox回归分析显示，单核细胞计数、CA125和甲胎蛋白对患者预后有显著影响，其中CA125成为一个独立的预后指标。
代谢物与临床指标的相关性研究结果
研究测量了ICC血清样本的各项临床参数。将先前确定的11种关键代谢物与临床因素进行关联。在正离子模式下，亚油酸与CA125显著相关，胆酸与CA15-3显著相关，D-谷氨酰胺与CA19-9显著相关，肌酸与γ-谷氨酰转肽酶和CA125均显著相关。在负离子模式下，肌酸与CA15-3和CA125显著相关，犬尿喹啉酸与CA125显著相关，胆酸与CA15-3显著相关，焦谷氨酸与单核细胞计数显著相关，N4-乙酰胞苷与癌胚抗原和碱性磷酸酶显著相关，L-精氨酸与癌胚抗原显著相关。
基于总生存期和无复发生存期对四个样本时期进行的生存分析显示时期间无显著差异。但对11种差异代谢物在正、负离子模式下的进一步生存分析表明，L-谷氨酸、N4-乙酰胞苷、胆酸和焦谷氨酸可影响ICC患者的预后。此外，结合临床因素和代谢物数据的Cox回归分析显示，CA19-9、CA15-3和亚油酸对胆管癌预后有显著影响，其中亚油酸成为一个独立的预后指标。
微生物与代谢物的相关性研究结果
进一步探究胆管癌中关键微生物与代谢物之间的相互作用，发现四种差异细菌与正离子模式下的20种代谢物水平以及负离子模式下的7种代谢物水平存在显著相关性。此外，先前实验确定的11种关键代谢物与特定微生物相关。在正离子模式下，乏养菌与肌酸呈显著正相关，肠球菌与犬尿喹啉酸呈显著正相关，消化球菌与L-精氨酸呈显著负相关。在负离子模式下，乏养菌与犬尿喹啉酸、亚油酸和肌酸呈显著正相关，韦荣球菌与L-大尿氨酸呈显著正相关，消化球菌仍与L-精氨酸呈显著负相关。
研究还利用关键代谢物和微生物构建随机森林分类器来预测复发，并进行5折交叉验证。散点图展示了影响复发预测的重要特征排序，当使用八个特征时，模型准确率达到74.68%。这些特征——亚油酸、L-精氨酸、肌酐、韦荣球菌、胆酸、焦谷氨酸、犬尿喹啉酸和N4-乙酰胞苷——显示出较高的预测准确性。
结合微生物组与代谢组进行多组学分型分析
研究筛选了同时具有粪便16S rRNA测序和血清代谢组学数据的ICC患者样本，共82份。将先前实验中确定的标志微生物和关键代谢物结合起来进行一致性聚类。五次交叉重复实验的平均轮廓宽度为0.55。最终，这些ICC样本被分为五种亚型。
分析五种肝型间的代谢物差异，发现在正离子模式下有38种，负离子模式下有19种代谢物存在显著差异。值得注意的是，胆酸在ICC中再次发挥了重要作用。对五种肝型进行的Kaplan-Meier生存分析显示，在总生存期上存在显著差异，其中肝型4预后最好，肝型5预后最差。此外，无复发生存期分析也揭示显著差异，肝型3预后最好，肝型1预后最差。标志微生物、代谢物和亚型的热图分布表明，韦荣球菌主要富集于3型肝型，肠球菌富集于5型肝型，胆酸富集于2型肝型。对五种肝型的差异丰度代谢物进行KEGG富集分析表明，这些代谢物主要参与影响生物过程的通路。
材料与方法
研究纳入了在福建医科大学孟超肝胆医院接受手术治疗的ICC患者。共收集健康对照粪便样本50份，ICC患者粪便样本117份及血清样本220份。癌症样本按四个时间期分类。16S rRNA测序用于粪便菌群分析。通过PCR扩增16S rRNA基因的V3-V4区并在Illumina NovaSeq平台上测序。对原始数据进行质量过滤、嵌合体去除和操作分类单元聚类。在本研究中，使用NovaSeq 6000平台的PE150测序模式进行宏基因组测序。原始测序读数经过过滤、去宿主污染后，与肠道微生物整合基因目录数据库比对进行物种注释。代谢组学分析中，每个血清样本经过提取后，使用超高效液相色谱系统与Q Exactive HFX质谱仪联用进行分析。数据通过R包进行α和β多样性分析、差异分析、主成分分析、KEGG富集分析、生存分析和相关性分析。基于关键微生物和代谢物，使用随机森林模型预测胆管癌复发，并应用一致性聚类算法整合16S微生物和代谢组数据进行多组学亚型识别。整体分析流程如图所示。
