脊髓损伤是一种灾难性的中枢神经系统创伤，常导致永久性的神经功能缺损。其核心障碍之一是受损的神经轴突难以再生和重新连接。在这个过程中，损伤部位形成的瘢痕组织扮演着复杂且关键的角色。传统上，胶质瘢痕（主要由反应性星形胶质细胞构成）被认为是阻碍再生的主要屏障。然而，占据损伤核心的致密纤维化瘢痕，其细胞来源和形成机制尚不完全清楚。近年来，血管周细胞（Pericytes）被发现具有高度的可塑性，并在多种器官纤维化中转化为产生胶原的肌成纤维细胞（myofibroblasts），这一过程被称为周细胞-肌成纤维细胞转化（Pericyte-to-myofibroblast transition, PMT）。但在脊髓损伤背景下，驱动PMT的关键信号分子是什么？又是哪些细胞在发出这些“转化指令”？这些问题的答案对于开发减轻纤维化、促进神经再生的新疗法至关重要。本研究发表在《Journal of Orthopaedic Translation》上，旨在揭示脊髓损伤后纤维化瘢痕形成的关键细胞与分子机制。
研究人员主要运用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析、体外细胞共培养与干预实验、以及体内小鼠脊髓损伤模型结合药理学阻断等关键技术方法。scRNA-seq数据来自公共数据库（GSE162610），涵盖未损伤及损伤后1、3、7天的脊髓组织，用于解析细胞动态和识别关键细胞亚群。体外实验使用从脊髓组织中分选的原代细胞进行。体内研究则采用了成年雌性C57BL/6J小鼠的完全性脊髓挤压伤模型，并通过鞘内注射CXCL4中和抗体或PI3K抑制剂LY294002进行干预。
3.1. 周细胞-肌成纤维细胞转化发生在脊髓损伤后
通过对脊髓组织的单细胞测序数据分析，研究人员鉴定出包括周细胞在内的主要细胞类型。他们发现，在脊髓损伤后，表达周细胞标志物Pdgfrβ的细胞中，肌成纤维细胞标志基因Acta2的表达显著上调。进一步的免疫荧光染色证实，损伤部位存在大量共表达PDGFRβ和α-SMA（由Acta2编码）的细胞，表明PMT过程在脊髓损伤后确实发生。
3.2. Pdgfrβ+Acta2+周细胞是PMT的主要贡献者
对Pdgfrβ+细胞进行亚群分析，发现了一个独特的第3簇周细胞。该簇细胞表达较低的经典周细胞标志物（如Pdgfrb, Rgs5），但高表达肌成纤维细胞标志物（如Acta2, Myh11）。拟时序分析显示，这些细胞位于周细胞向肌成纤维细胞分化的轨迹上。功能富集分析表明，该簇细胞基因与细胞外基质重塑相关。流式细胞术和免疫荧光进一步证实，这群Pdgfrβ+Acta2+细胞是发生PMT、贡献于纤维化的主要周细胞亚群。
3.3. 脊髓损伤后CXCL4增加并促进PMT
通过测序和实验验证，研究人员发现趋化因子CXCL4在脊髓损伤后表达显著上调，并在损伤后第3天达到峰值。体外实验中，外源性CXCL4能以剂量依赖的方式诱导原代周细胞高表达α-SMA和Collagen I，同时下调PDGFRβ和NG2，成功驱动其向肌成纤维细胞表型转化。
3.4. 阻断CXCL4可改善纤维化瘢痕并增强功能恢复
在脊髓损伤小鼠模型中，鞘内注射CXCL4中和抗体可显著减少损伤部位α-SMA、Collagen I、Laminin和Fibronectin等纤维化相关蛋白的表达，Masson三色染色也显示胶原沉积减少。更重要的是，抗CXCL4治疗促进了皮质脊髓束（CST）轴突和5-HT+轴突跨越损伤区的再生，并显著改善了小鼠的后肢运动功能（BMS评分和足迹分析）。
3.5. CXCL4通过激活PI3K/Akt信号通路促进PMT
对CXCL4处理的周细胞进行转录组学分析，发现PI3K/Akt信号通路被显著激活。Western blot证实CXCL4能快速诱导PI3K磷酸化。使用PI3K抑制剂LY294002或Akt抑制剂MK2206处理，可以逆转CXCL4诱导的周细胞表型转化。在体实验也表明，抑制PI3K通路能减少损伤部位的PMT和纤维化。
3.6. Spp1+Fn1+巨噬细胞亚群是脊髓损伤后CXCL4的主要来源
单细胞测序分析揭示了一个高表达促纤维化基因Spp1和Fn1的巨噬细胞亚群，该亚群具有最高的细胞外基质调节评分。重要的是，Cxcl4（Pf4）基因主要在该亚群中特异性高表达。免疫荧光和流式细胞术进一步证实，Spp1+Fn1+巨噬细胞是损伤部位CXCL4蛋白的主要生产者。
3.7. Spp1+Fn1+巨噬细胞通过CXCL4/CXCR3轴促进周细胞PMT
细胞通讯分析显示，脊髓损伤后，Spp1+Fn1+巨噬细胞向Pdgfrβ+Acta2+周细胞发送信号的强度显著增加，其中CXCL信号通路是主要富集的通路之一。CXCL4的唯一受体CXCR3在周细胞上表达。建立两种细胞的共培养体系后发现，Spp1+Fn1+巨噬细胞能诱导周细胞发生PMT，而这种效应可通过敲低巨噬细胞的Cxcl4或周细胞的Cxcr3基因来阻断。
3.8. Spp1+Fn1+巨噬细胞中CXCL4的表达受转录因子MAFB调控
通过生物信息学分析，研究人员发现转录因子MAFB在Spp1+Fn1+巨噬细胞中特异性高表达。染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实MAFB能直接结合到Cxcl4基因的启动子区域。敲低Mafb能显著降低Spp1+Fn1+巨噬细胞中CXCL4的mRNA和蛋白表达水平，表明MAFB正向调控CXCL4的转录。
研究结论与讨论部分系统性地总结了本研究的发现。该研究首次揭示了脊髓损伤后纤维化形成的一条新轴：损伤局部浸润的Spp1+Fn1+促纤维化巨噬细胞亚群，在转录因子MAFB驱动下高表达趋化因子CXCL4；CXCL4通过与周细胞表面的受体CXCR3结合，激活其下游的PI3K/Akt信号通路，从而驱动周细胞转化为产生大量细胞外基质的肌成纤维细胞，最终形成致密的纤维化瘢痕，阻碍轴突再生。靶向阻断CXCL4或其下游通路，能有效抑制这一转化过程，减轻纤维化，为轴突再生创造更有利的微环境，并最终促进运动功能恢复。
该研究的重要意义在于：首先，它明确了Spp1+Fn1+巨噬细胞是驱动纤维化的关键免疫细胞亚群，并发现了MAFB-CXCL4这一新的调控模块。其次，它详细阐明了CXCL4/CXCR3/PI3K/Akt信号轴在周细胞纤维化转化中的核心作用，为干预提供了明确的分子靶点。最后，研究通过体内外实验验证了靶向该通路的治疗潜力，即使用CXCL4中和抗体或PI3K抑制剂可以改善病理和功能结局，这为开发治疗脊髓损伤后纤维化的新策略奠定了坚实的理论基础。尽管研究存在一些局限性，如未检测血浆CXCL4水平、需后续使用细胞特异性基因敲除小鼠验证等，但其清晰地描绘了脊髓损伤后纤维化瘢痕形成的一个关键细胞与分子环路，为未来转化医学研究提供了新的方向。
