1 引言
糖尿病足是发生于1型或2型糖尿病患者足部的创面，以感染、溃疡和/或深部组织损伤为特征。其发病机制复杂，涉及感染、微血管与大血管病变及神经损伤等多种因素。糖尿病足溃疡是全球性的重大公共卫生挑战，患者五年死亡率高达34%，且是非创伤性下肢截肢的主要原因。当前临床管理指南侧重于感染控制、缺血再血管化和机械减压，虽能挽救肢体，但常未能从根本上解决慢性创面不愈的根本挑战。
DFU是糖尿病最严重的慢性并发症，其病理生理学基础是高血糖诱导的组织损伤导致的伤口愈合障碍。越来越多的证据表明，持续高血糖会通过晚期糖基化终末产物积累、线粒体氧化应激加剧和持续的炎症反应等机制，形成不利的微环境，损害上皮再生、血管生成和细胞外基质重塑。因此，超越传统的“抗感染”和“血管通畅”范式，探索这一病理微环境的代谢基础，并找出能够重启正常修复过程的关键内源性调控因子，已成为克服当前治疗局限的新前沿。
代谢组学通过对生物系统内源性小分子代谢物组成谱和动态变化的系统表征，为揭示潜在的诊断生物标志物和治疗靶点提供了直接手段。在糖尿病及其并发症领域，氨基酸、脂肪酸和胆汁酸等代谢谱的异常变化与胰岛素抵抗、血管内皮功能障碍和慢性炎症密切相关。胆汁酸，尤其是初级胆汁酸如鹅去氧胆酸，能够激活法尼醇X受体和G蛋白偶联胆汁酸受体等关键核受体和膜受体，从而精确调节葡萄糖稳态、能量消耗、先天免疫反应和炎症通路。有证据表明，胆汁酸代谢紊乱与2型糖尿病和非酒精性脂肪肝的发生发展紧密相连，CDCA可增强肝及外周组织的胰岛素敏感性并发挥抗炎作用。然而，胆汁酸在糖尿病足溃疡这一以严重局部组织损伤为特征的病理进展中是否起关键作用尚不明确。
本研究通过整合临床代谢组学与功能验证，应用非靶向代谢组学技术全面表征DFU患者的血清代谢谱，精确识别与疾病进展相关的关键代谢物，并利用高糖细胞模型验证候选分子对伤口修复细胞功能的调控作用，旨在揭示DFU的新机制，为“代谢微环境重塑”治疗策略提供理论依据。
2 材料与方法
本研究为病例对照研究，严格遵循《赫尔辛基宣言》原则，并获得河南科技大学第一附属医院伦理委员会批准。病例组包括18名糖尿病足患者和18名无足部并发症的糖尿病患者，对照组为18名年龄和性别匹配的健康个体。糖尿病足的诊断和严重程度分级依据国际糖尿病足工作组和美国传染病学会的联合指南。
所有临床数据均从电子病历系统中标准化提取，包括人口统计学特征、糖尿病相关参数、足部溃疡特征、并发症及实验室指标。实验室指标涵盖糖代谢、血脂谱、炎症标志物、凝血功能、肝肾功能等。
血清样本采集后，进行非靶向代谢组学分析。样本预处理后，使用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱质谱系统进行分析，采用正负离子电喷雾电离模式。数据经处理后进行多变量统计分析，包括主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析。差异代谢物的筛选标准为：变量重要性投影值>1.0，错误发现率校正P值<0.05，倍数变化>1.5或<0.67。通过二元逻辑回归分析筛选DF的保护因素。
在细胞功能验证实验中，使用人皮肤成纤维细胞建立高糖损伤模型，实验分组包括对照组、高糖模型组和高糖加CDCA干预组。通过CCK-8法检测细胞增殖，Transwell迁移实验和划痕愈合实验评估细胞迁移能力，实时荧光定量PCR检测修复相关基因表达，蛋白质印迹法分析FXR/PKA/AMPK信号通路关键蛋白表达。
3 结果
3.1 DF患者表现出显著的代谢紊乱、全身炎症和血管并发症
三组间年龄、性别等基本人口统计学特征无显著差异。与DM组相比，DF组平均住院时间显著延长，农村居民比例最高。在代谢和炎症标志物方面，DF组表现出特征性的失调模式：虽然空腹血糖低于DM组，但两组均显著高于健康对照组。DF组血脂异常明显，表现为甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平升高，高密度脂蛋白胆固醇水平降低。全身性炎症标志物在DF组显著升高，高敏C反应蛋白中位数水平达到9.56 mg/L，显著高于DM组和健康对照组。同时，红细胞沉降率、白细胞计数和中性粒细胞计数均显著增加。凝血功能分析表明，DF组的纤维蛋白原和D-二聚体水平较其他两组显著升高，提示明显的高凝状态。在并发症方面，DF组血管受累发生率显著更高，94.44%的DF患者存在血管病变，且下肢血管病变最为普遍。此外，DF组合并心脏病和糖尿病肾病的比例也显著高于DM组。
3.2 非靶向代谢组学揭示DF的特征性代谢谱并识别关键下调代谢物
质量控制样本紧密聚集，表明数据质量稳定。OPLS-DA模型有效展示了健康对照组、DM组和DF组之间的显著代谢分离，且模型有效性通过置换检验得到确认。结果明确显示，在从DM进展到DF的过程中，精确识别出三个关键下调分子：鹅去氧胆酸、1-甲基烟酰胺和三甲胺N-氧化物。通路富集分析进一步揭示，DM与DF组之间的代谢紊乱主要与ABC转运蛋白通路、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、半胱氨酸/甲硫氨酸代谢以及淀粉和蔗糖代谢等通路相关。
3.3 功能代谢组学与回归分析共同确定CDCA为DF的关键保护因子
方差膨胀因子诊断显示CDCA、1-MNA和TMAO的VIF值均小于5，预测变量间无严重多重共线性。单因素逻辑回归分析表明，CDCA和1-MNA与DF风险呈显著负相关。在多因素逻辑回归模型中，CDCA和1-MNA均保持与降低DF风险的独立显著关联。鉴于CDCA在调节糖脂代谢、胰岛素敏感性以及抗菌抗炎方面具有公认的多方面生物学作用，而1-MNA作用的证据相对较少，因此选择CDCA作为后续功能验证的主要候选分子。
3.4 细胞实验证实CDCA逆转高糖诱导的成纤维细胞功能障碍
3.4.1 CDCA增强高糖条件下HSF的增殖能力
通过CCK-8法评估不同浓度和处理时间的CDCA对HSF增殖能力的影响。结果一致表明，与对照组相比，2.5 nM至25 nM的CDCA处理未显著影响细胞活力，而50 nM–200 nM的CDCA则导致细胞活力呈剂量依赖性显著降低。因此，选择5 nM、10 nM和25 nM CDCA作为低、中、高浓度用于后续实验，标准化处理时长为24小时。
将HSF细胞暴露于高糖条件下，加或不加CDCA处理。结果显示，高糖模型组的细胞活力较正常对照组显著降低。值得注意的是，CDCA干预以剂量依赖性的方式减轻了这种抑制作用。
3.4.2 CDCA增强高糖条件下HSF的迁移能力
Transwell迁移实验和划痕愈合实验的结果一致表明，高糖处理显著损害了人皮肤成纤维细胞的迁移能力。与高糖组相比，CDCA干预组穿过Transwell膜的细胞数量显著增加。在划痕愈合实验中，CDCA处理后伤口闭合率显著提高，尤其在25 nM浓度下，几乎恢复到正常水平。
3.4.3 CDCA上调组织修复相关基因的mRNA表达
通过qRT-PCR评估了与细胞增殖和迁移相关的关键基因表达水平。结果表明，在高糖条件下，增殖标志物PCNA、肌成纤维细胞分化标志物α-SMA和细胞骨架蛋白Vimentin的mRNA表达受到显著抑制。CDCA干预后，这些基因的mRNA表达呈剂量依赖性上调，这为CDCA介导的细胞增殖和迁移增强提供了分子基础。
3.4.4 CDCA通过激活FXR/PKA/AMPK信号通路发挥保护作用
为了进一步阐明CDCA逆转高糖诱导的成纤维细胞功能障碍的分子机制，检测了与胆汁酸信号和细胞能量代谢密切相关的FXR、PKA和AMPK通路关键蛋白的表达。蛋白质印迹结果表明，与正常对照组相比，高糖模型组的FXR表达显著降低，p-PKA水平下降，而p-AMPK水平显著升高，提示高糖条件下胆汁酸信号受到抑制，细胞能量应激增强。CDCA干预以剂量依赖性的方式上调了FXR的表达。同时，p-PKA水平显著增加，而p-AMPK的活化被显著抑制。这些发现暗示，CDCA可能通过激活FXR和PKA信号并抑制AMPK的过度活化，来减轻高糖诱导的成纤维细胞功能障碍。
4 讨论
本研究通过整合临床代谢组学和功能验证，系统地阐明了DFU的代谢失调特征，并首次将CDCA确定为DF的关键内源性保护因子。核心发现揭示了CDCA是DF的疾病特异性保护代谢物，其血清浓度显著降低与DF发生风险增加独立相关。这一发现不仅加深了对DF代谢基础的理解，也为开发基于代谢调节的新型治疗策略提供了有前景的途径。
在机制层面，本研究证实了CDCA通过激活与细胞增殖和迁移相关的通路，有效缓解高糖诱导的细胞损伤。体外实验表明，在其生理浓度范围内，CDCA以剂量依赖性的方式逆转高糖条件下HSF的功能障碍。这种保护作用伴随着增殖标志物PCNA、肌成纤维细胞分化标志物α-SMA和细胞骨架蛋白Vimentin的显著上调。这些分子变化共同构成了CDCA介导的伤口修复增强的机制基础。此外，本研究在DF相关细胞模型中证明了CDCA对FXR/PKA/AMPK信号通路的调节作用。当前结果清楚地表明，CDCA显著逆转了高糖诱导的FXR表达下调和PKA磷酸化抑制，同时也减轻了AMPK的过度激活。
虽然CDCA在体外显示出有希望的伤口修复潜力，但其在复杂伤口环境中的稳定性、局部渗透性和靶向递送能力有待提高。基于纳米载体的药物递送系统具有提高生物利用度、控制释放和靶向能力的特点。因此，将CDCA封装在立方脂质体或传递体等纳米载体中，可以提高其在伤口部位的稳定性、皮肤渗透性和持续释放能力。这种方法与“代谢微环境重塑”的策略相一致，可能加速基于CDCA的DFU治疗的转化发展。
本研究指出了一些局限性。首先，单中心设计和有限的样本量可能会削弱研究结果的普遍性。其次，研究主要集中在细胞水平验证，缺乏动物模型的支持证据。第三，识别CDCA为保护因子的初始逻辑回归模型未对糖尿病病程或合并症等潜在临床混杂因素进行调整。更重要的是，CDCA保护作用的具体分子机制，特别是是否通过FXR和TGR5等经典胆汁酸受体介导，仍有待通过基因敲除等实验方法彻底阐明。
5 结论
本研究通过整合临床代谢组学和功能验证，系统地表征了DFU的代谢失调特征，并首次确定CDCA为关键的内源性保护因子。研究结果表明，DF患者的血清CDCA水平显著低于无并发症的糖尿病患者和健康对照组。此外，多因素逻辑回归分析证实，CDCA是防止DF进展的独立保护因素。进一步的细胞功能实验揭示，在生理浓度范围内，CDCA能有效逆转高糖诱导的成纤维细胞功能障碍，且其潜在机制与增强细胞增殖、改善迁移能力以及上调PCNA和α-SMA等修复相关基因密切相关。总之，本研究不仅阐明了CDCA在DF发病机制中的保护作用及潜在分子机制，也为开发针对代谢微环境的创新策略提供了坚实的实验基础和潜在治疗靶点。
