引言
禽大肠杆菌病主要由禽致病性大肠杆菌（APEC）引起，是危害养禽业的重要细菌性疾病，可导致急性败血症、气囊炎、心包炎和肝周炎等多种病变，造成严重经济损失。APEC具有血清型众多、抗原变异大等特点，使得疫苗防控面临挑战。目前，抗生素联合治疗是控制该病的主要手段，但抗生素的滥用导致了多重耐药菌株的出现，带来疗效下降、公共卫生风险和药物残留等问题。因此，开发替代性抗菌策略，例如噬菌体疗法，变得尤为迫切。
噬菌体是感染并裂解宿主细菌的病毒。与抗生素相比，噬菌体制剂具有宿主特异性强、能靶向多重耐药菌、不破坏肠道菌群平衡和无毒等优势。然而，其宿主范围窄是限制噬菌体疗法应用的主要瓶颈。噬菌体吸附是感染的关键第一步，涉及表面受体结合蛋白（RBP）与细菌受体的特异性结合，这决定了感染的专一性。不同的噬菌体，其RBP及其相应受体在结构和特异性上各异。例如，T4噬菌体通过其尾丝末端的gp37蛋白识别细菌表面的OmpC蛋白。这种高度特异性的分子识别机制严格限制了噬菌体的感染谱。因此，识别和理解新型噬菌体的RBP及其作用机制，是拓展噬菌体宿主谱和设计更有效噬菌体鸡尾酒配方的核心基础。
本研究旨在分离和表征新型噬菌体vB_EcoM_SD286，通过基因组和生物信息学分析确定其关键的功能性受体结合蛋白，并通过实验验证候选蛋白gp38的吸附活性。通过确认gp38的RBP样功能，为鉴定大肠杆菌噬菌体中的新型RBP建立方法学框架，并为开发基于工程化广谱噬菌体疗法的新型抗菌或诊断工具提供分子靶点和理论基础。
材料与方法
本研究使用了从聊城大学噬菌体研究中心实验室获取的E. coli SD405及其他100株临床分离的大肠杆菌菌株。噬菌体vB_EcoM_SD286从山东省农场污水中分离，并经过六轮纯化。研究采用双层平板法测定噬菌体裂解谱、最佳感染复数（MOI）、滴度并绘制一步生长曲线。通过透射电子显微镜观察噬菌体形态。评估了噬菌体在不同pH、温度和氯仿条件下的稳定性。全基因组测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行，使用Trimmomatic进行原始数据质控，ABySS进行组装，GeneMarkS预测开放阅读框（ORF），并通过BLASTp、COG、GO、KEGG等数据库进行功能注释。利用PhaBOX工具预测噬菌体生活方式。
基于gp38的氨基酸序列，使用ProtParam分析其基本理化性质，ProtScale评估亲疏水性，TMHMM Server v2.0预测跨膜结构域，NovoPro SignalP分析信号肽，PSIPRED和SWISS-MODEL分别预测其二级和三级结构。利用AlphaFold3预测了gp38、gp66和溶菌酶（Lys）的三维结构。
通过PCR扩增gp38基因，并克隆至pET-28a(+)载体，构建重组表达质粒pET-28a(+)-gp38，转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达。重组蛋白通过镍柱亲和层析进行纯化，并通过SDS-PAGE和Bradford法进行鉴定和浓度测定。
为验证gp38蛋白的功能，进行了竞争吸附实验和宿主细菌-蛋白结合实验。竞争吸附实验中，将宿主细菌E. coli SD405（108 CFU/mL）与不同浓度（1.6 mg/mL和0.8 mg/mL）的gp38蛋白预孵育后，再加入噬菌体vB_EcoM_SD286（108 PFU/mL），通过测定游离噬菌体滴度评估gp38对噬菌体吸附的抑制效果。同时设置了阴性对照（无关蛋白Lys）和阳性对照（同源蛋白gp66）。此外，还评估了gp38蛋白对细菌活力的影响，以排除其溶菌活性对吸附抑制结果的干扰。在宿主细菌结合实验中，将细菌与gp38蛋白共孵育不同时间后，通过测定上清液中蛋白浓度的变化来量化gp38与细菌的结合动力学。
所有数据均使用GraphPad Prism v8.4.3进行统计分析，采用多重t检验评估显著性，实验均进行三次重复。
结果
形态学特征、裂解谱与平板效率
噬菌体vB_EcoM_SD286在双层平板上形成大小均一的噬菌斑。透射电镜显示，该噬菌体具有规则的二十面体头部和螺旋对称的尾部，属于有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科。裂解谱测定显示，该噬菌体能裂解39株测试菌株中的39%，覆盖率为39%。效率平板测定（EOP）表明，vB_EcoM_SD286具有较窄的宿主范围，仅在少数宿主（如E. coli SD288、SD350等）上表现出高复制效率（EOP ≥ 0.5），绝大多数菌株对其完全耐药。
噬菌体vB_EcoM_SD286的生物学特性
在MOI为0.01时，噬菌体滴度最高（约5.36 × 109 PFU/mL），确定为最佳MOI。该噬菌体在广泛的pH范围（5–11）内稳定长达180分钟，但在pH 3或pH 13条件下1小时内活性丧失至检测不到。氯仿处理（0–50%体积比）对噬菌体存活率无显著影响，表明其结构不含脂质成分。温度稳定性实验显示，噬菌体在4°C、25°C及40–50°C下稳定，60°C处理20分钟后滴度略有下降，70°C时滴度急剧下降，80°C处理20分钟后完全失活。一步生长曲线显示潜伏期约为25分钟，爆发量约为33 PFU/细胞。
噬菌体vB_EcoM_SD286的基因组测序与比较基因组学分析
全基因组测序显示，vB_EcoM_SD286为线性双链DNA分子，全长52,891 bp，GC含量为46.06%。未检测到tRNA基因、毒力因子或抗生素抗性基因。PhaBOX分析将其分类为“裂解性噬菌体”。基因组注释共鉴定出74个ORF，其中31个编码功能已知蛋白，43个为推测蛋白。
基于Viptree数据库的进化树分析显示，vB_EcoM_SD286与Salmonella phage UPF_BP2和BP63亲缘关系最近，两者均属于有尾噬菌体纲和Rosemountvirus属。VICTOR系统发育分析进一步表明，vB_EcoM_SD286与Escherichia phages vB_EcoM_IntR、vB_EcoM_swi3和vB_EcoM_SD350聚集在同一分支。VIRIDIC分析显示，其与Escherichia phage vB_EcoM_SD350的基因组相似性高达99.4%，表明两者遗传关系极为密切。
gp38蛋白的基本理化性质与结构分析
gp38蛋白由123个氨基酸组成，分子量为13.75306 kDa，理论等电点（pI）为9.65，在大肠杆菌中的半衰期大于10小时，不稳定指数为33.98，属于稳定蛋白。亲疏水性分析表明gp38是一个稳定的亲水蛋白。跨膜结构域和信号肽预测结果显示，gp38不含跨膜螺旋和信号肽。二级结构预测显示，α-螺旋、β-折叠和无规卷曲分别占44.7%、28.5%和26.8%。三级结构预测显示gp38整体呈不规则形状。AlphaFold3预测的结构模型显示，gp38主要以单体形式存在，其DUF7173结构域位于残基6–119之间。
gp38蛋白的表达与纯化
成功构建了重组质粒pET-28a(+)-gp38，并在E. coli BL21(DE3)中诱导表达。SDS-PAGE分析显示，gp38主要在沉淀（包涵体）中表达。确定37°C和0.5 mmol/L IPTG为最佳诱导条件。通过镍柱亲和层析纯化并复性后，获得了浓度为1.15 mg/mL的gp38蛋白。作为对照的gp66和Lys蛋白也通过相同的流程成功表达和纯化。
gp38蛋白抑制噬菌体vB_EcoM_SD286对宿主细菌的吸附
竞争吸附实验结果表明，重组gp38蛋白能显著抑制噬菌体vB_EcoM_SD286对宿主细菌的吸附。在gp38浓度为1.6 mg/mL时，游离噬菌体滴度显著高于阴性对照组，表明gp38竞争性占据了E. coli SD405表面的受体位点，从而阻断了噬菌体的正常吸附。相比之下，阴性对照蛋白Lys未表现出竞争性抑制作用，阳性对照蛋白gp66也未显示出显著抑制，这进一步证实了gp38功能的特异性。抑制效果具有浓度依赖性，1.6 mg/mL的抑制效果比0.8 mg/mL更为显著。
为了排除gp38蛋白本身具有溶菌活性而导致细菌死亡、进而影响吸附测定的可能性，评估了gp38对细菌活力的影响。结果显示，gp38处理并未降低E. coli SD405的CFU/mL，证实其在实验条件下不具有溶菌特性。
宿主细菌与gp38蛋白的结合实验进一步验证了上述结果。定量分析表明，gp38蛋白与宿主细菌之间存在高度特异、快速且高效的结合相互作用。结合量在2–4分钟内达到稳定，可能在此时达到饱和，并在16分钟后保持稳定，无明显变化。经阴性对照组（PBS + gp38）校正后，牛血清白蛋白（BSA）对照组有效排除了非特异性结合的干扰。这些发现表明，gp38蛋白作为一种关键的细菌受体结合组分发挥作用，其快速且特异的结合过程在数分钟内即可完成。
讨论
本研究聚焦于应对禽致病性大肠杆菌（APEC）带来的持续挑战。APEC血清型的多样性和抗原变异性严重限制了传统疫苗的效果。噬菌体疗法因其宿主特异性高、对肠道微生态干扰小、作用机制与抗生素根本不同等优势而备受关注。然而，其临床应用的一个主要瓶颈在于宿主范围窄，这种特异性源于感染早期噬菌体RBP与宿主细菌表面受体之间的精确分子识别与结合。
本研究利用从山东省农场分离的大肠杆菌有尾噬菌体vB_EcoM_SD286，深入探究了其感染机制。通过生物学特性分析和全基因组测序，揭示了该噬菌体的生物学特性和遗传信息。其平板效率（EOP）谱显示其具有狭窄的宿主特异性，仅对少数测试菌株具有高效感染性。通过比较基因组学分析与关键蛋白的生物信息学调查相结合，利用原核表达技术成功获得了重组蛋白。最关键的一步是创新性地应用竞争吸附实验进行功能验证。这种方法为直接测量重组蛋白与宿主细菌表面受体之间的特异性结合相互作用提供了强大且相对简单的工具。
对gp38蛋白的BLASTP搜索显示，其最接近的同源物被注释为“DUF7173结构域包含蛋白”。未知功能结构域（DUF）代表了生物学功能尚未明确的大型蛋白质家族。有证据表明，DUF在微生物-噬菌体相互作用中也扮演着关键角色。然而，此类蛋白质在非植物系统（包括微生物）中的功能仍然知之甚少，特别是DUF7173结构域的生物学功能尚未阐明。因此，本研究旨在探索DUF7173结构域在微生物环境中的潜在功能，并以gp38蛋白为主要分析对象。
本研究通过详细的结合动力学和特异性分析，证实了gp38作为宿主细菌受体的效率和特异性，从而为理解其分子相互作用机制奠定了坚实基础。竞争吸附实验清楚地表明，重组gp38蛋白可以干扰噬菌体的吸附，这意味着两者竞争宿主细胞表面相同或密切相关的受体位点。
本研究初步确定了潜在的RBP候选者，尽管尚未精确绘制其功能结构域。确定负责受体结合的关键结构基序或氨基酸残基，对于阐明识别特异性以及设计具有增强特性（如更广泛的宿主范围或更强的结合亲和力）的修饰RBP至关重要。
总之，本研究通过整合基因组分析、生物信息学预测、分子生物学技术和功能验证实验，成功建立了一个用于筛选和验证噬菌体受体结合蛋白的完整工作流程。从噬菌体vB_EcoM_SD286中鉴定出的具有RBP样活性的重组蛋白，不仅增强了对特定噬菌体-宿主相互作用机制的理解，而且为基于RBP工程设计广谱或改进的噬菌体制剂提供了有价值的分子靶点和理论框架。
结论
本研究成功分离并表征了vB_EcoM_SD286，这是一株具有严格裂解性且对特定大肠杆菌菌株具有高效但狭窄感染谱的噬菌体。其明确的宿主范围和裂性生活史通过生物学和生物信息学分析得到证实。更重要的是，竞争吸附实验和宿主结合实验证实，重组gp38蛋白对宿主细菌表现出强烈的吸附活性，其功能类似于RBP。这一发现为进一步鉴定和表征大肠杆菌噬菌体中的新型RBP奠定了坚实的分子基础，并为开发基于噬菌体的抗菌策略提供了宝贵的见解。
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